徐丹丹,刘 洋

中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院检验科,安徽合肥 230031

急性淋巴细胞白血病是一种以骨髓、外周血原始及幼稚淋巴细胞浸润为特征的血液系统疾病,同时也是儿童及青少年高发的肿瘤疾病[1-2]。近年来虽随着我国医疗技术地不断进步,急性淋巴细胞白血病患者临床治疗效果已得到有效改善,但仍有部分患者预后较差[3]。因此,探寻有效的诊断和预后标志物为临床早期选择最佳治疗方案提供依据至关重要。微小RNA(miRNA)由内源基因编码,目前广泛参与细胞生长、分化及凋亡等多个生物过程[4]。miR-377是一种非编码miRNA,已有研究发现miR-377在其他肿瘤疾病中异常表达,并且与疾病预后密切有关[5]。而SET及MYND结构域包含蛋白3(SMYD3)是新发现的一种能够参与组蛋白甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶[6],既往研究发现,SMYD3在多种疾病中高表达,并且与患者预后密切相关[7]。但目前miR-377和SMYD3与急性淋巴细胞白血病发病及预后的关系尚不清楚。因此,本研究拟探讨急性淋巴细胞白血病患者miR-377和SMYD3表达水平及其临床预后意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院2016年3月至2020年6月收治的135例急性淋巴细胞白血病患者作为观察组,其中男80例,女55例;年龄20～59岁,平均(40.69±2.36)岁。纳入标准:(1)观察组均符合《血液病诊断及疗效标准》中关于急性淋巴细胞白血病的诊断标准[8];(2)所有纳入患者及家属对本研究知情同意;(3)年龄20～60岁。排除标准:(1)肝、肾、心等重要脏器存在功能不全或衰竭者;(2)合并严重感染者;(3)中枢神经系统白血病、成熟淋巴细胞白血病等其他类型白血病者;(4)接受化疗耐药治疗者;(5)精神病史者;(6)临床资料不完整或中途退出者。同时选择同期120例体检健康者作为对照组,其中男70例,女50例;年龄21～60岁,平均(40.88±2.87)岁。本研究经本院伦理委员会审批通过。

1.2方法 样本收集:抽取患者入院及健康者体检时清晨外周静脉血样本8 mL,每份样本液4 mL,随后加入等体积的淋巴细胞分离液,并在室温下以2 000×g离心10 min,然后将离心管中白雾状层转移至另一干净离心管中,用Hank液清洗两遍后,将单核细胞浓度调整为1×107/mL,在无菌1.5 mL PE管中加入100 μL单核细胞悬液,分别加入异硫氰酸荧光素标记的HLR-DR抗体,经4 ℃培养30 min,存放至-20 ℃冰箱内备用。

RNA提取:从-80 ℃冰箱取出样本后按照3倍体积比例加入提取试剂Trizol后充分摇匀,室温下静置15 min,随后4 ℃下2 000 r/min离心15 min,使用EP管吸取上部液体血清,提取总miRNA。具体方法参照miRNA试剂盒。

检测方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测外周血miR-377、SMYD3表达水平,反应条件为:94 ℃、5 min,94 ℃、30 s,60 ℃、35 s,72 ℃、10 s,共35个循环。miR-377引物:上游5′-ATCACACAAAGGCAAC-3′,下游5′-GTGCAGG GTCCGAGG-3′;U6引物:上游5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,下游5′-GGA ACGTTCAGAATTTA-3′。SMYD3引物:上游5′-TGAATGTGACTGTTTCCGTTGC-3′,下游5′-ATTGCTGCTTATGATCGCCTGG-3′;U6引物:上游5′-GAACGGTGAAGGTGACAG-3′,下游5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′。利用CFX manager 3.0软件对Cq值进行分析,再通过2-ΔΔCt法计算血清miR-377、SMYD3表达水平。

1.3观察指标 观察记录各组患者年龄、性别、免疫分型、危险度分型、骨髓原幼细胞比例,以及入院时、入院1月后血红蛋白(Hb)、血小板计数(PLT)、白细胞计数(WBC)、乳酸脱氢酶(LDH)等临床资料。

疗效标准[9]:完全缓解(CR)表示临床症状消失,原始细胞+幼稚淋巴细胞比例<5%;部分缓解(PR)表示临床症状缓解,骨髓中原始细胞+幼稚淋巴细胞比例为5%～20%;未缓解(NR)表示临床症状未缓解,骨髓中原始细胞+幼稚淋巴细胞比例>20%。

随访:本研究所有患者均随访2年,截止时间为2022年6月,并记录miR-377、SMYD3水平低表达和高表达患者的生存情况。

2 结 果

2.1两组miR-377、SMYD3表达水平比较 观察组miR-377表达水平低于对照组(P<0.05),SMYD3表达水平高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组miR-377、SMYD3表达水平比较

2.2miR-377、SMYD3表达水平与急性淋巴细胞白血病患者临床指标的关系 本研究根据均数将外周血miR-377、SMYD3表达水平分为高表达和低表达。miR-377>3.65为高表达组(75例),miR-377≤3.65为低表达组(60例),SMYD3>4.11为高表达组(62例),SMYD3≤4.11为低表达组(73例)。miR-377高表达组与低表达组患者的年龄,性别,免疫分型,Hb(入院时、入院1月后),PLT(入院时、入院1月后)比较差异均无统计学意义(P>0.05),miR-377高表达组的危险度分型,WBC(入院时、入院1月后),LDH(入院时、入院1月后),骨髓原幼细胞比例均明显低于miR-377低表达组(P<0.05)。SMYD3高表达组与低表达组患者的年龄,性别,免疫分型,Hb(入院时、入院1月后),PLT(入院时、入院1月后)比较差异均无统计学意义(P>0.05),SMYD3高表达组的危险度分型,WBC(入院时、入院1月后),LDH(入院时、入院1月后),骨髓原幼细胞比例均明显高于SMYD3低表达组(P<0.05)。见表2。

表2 miR-377、SMYD3表达水平与急性淋巴细胞白血病患者临床指标的关系(n或

2.3急性淋巴细胞白血病miR-377和SMYD3表达水平与临床疗效的关系 本研究根据临床疗效将观察组患者分为CR组(44例)、PR组(60例)、NR组(30例)。CR组miR-377、SMYD3表达水平与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);miR-377表达水平从低到高依次为NR组、PR组、CR组、对照组(P<0.05),SMYD3表达水平从高到低依次为NR组、PR组、CR组、对照组(P<0.05)。见表3。

表3 miR-377、SMYD3表达水平与急性淋巴细胞白血病患者临床疗效的关系

2.4急性淋巴细胞白血病miR-377、SMYD3表达水平与预后的关系 本研究随访患者2年,记录了所有患者的生存时间,经Kaplan-Meier生存分析发现,miR-377高表达组总生存率(65.33%,49/75)明显高于miR-377低表达组(41.67%,25/60)(P<0.05),见图1;SMYD3高表达组总生存率(41.94%,26/62)明显低于SMYD3低表达组(65.75%,48/73)(P<0.05),见图2。

图1 miR-377表达水平与患者生存关系图

图2 SMYD3表达水平与患者生存关系图

2.5影响急性淋巴细胞白血病患者预后的多因素Cox回归模型分析 本研究将表2单因素分析中差异有统计学意义(P<0.05)的因素设为自变量进行多因素Cox回归模型分析,结果显示,危险度分型、WBC、LDH、骨髓原幼细胞比例、miR-377、SMYD3均为影响急性淋巴细胞白血病患者预后的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 急性淋巴细胞白血病患者预后的多因素Cox回归模型分析

3 讨 论

急性淋巴细胞白血病作为血液系统恶性肿瘤,其发病率占急性白血病的70%以上[10]。虽目前临床治疗水平有一定提升,但仍有部分患者临床预后较差,因此为进一步改善患者预后,早期评估预后具有重要意义。因此,本研究拟探讨急性淋巴细胞白血病患者miR-377和SMYD3表达水平与临床预后意义。

miRNA是一类长度为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,可通过序列部分互补结合抑制目的基因的表达,研究发现其具有调控分化、增殖、凋亡、迁移等细胞行为[11]。既往已有相关研究显示,miRNA异常表达在许多肿瘤中发挥促进癌细胞增殖及抑制凋亡等作用[12]。既往研究发现,miR-377在弥漫大B细胞淋巴瘤组织中表达下调,且可预测不良预后[13]。而本研究结果显示,观察组miR-377表达水平低于对照组(P<0.05),说明miR-377在急性淋巴细胞白血病患者中表达下调,与以上研究结果一致。同时本研究发现,miR-377高表达组患者的危险度分型,WBC(入院时、入院1月后),LDH(入院时、入院1月后),骨髓原幼细胞比例均明显低于miR-377低表达组(P<0.05),即miR-377低表达患者骨髓原幼细胞比例异常增加,危险分级上升,WBC与LDH升高,表示miR-377低表达可能与患者病情进展相关,并且能够在一定程度反映患者疾病程度。有研究发现,miR-377表达水平降低可导致癌细胞异常增殖[14]。本研究通过分析miR-377与疗效的关系发现,NR组miR-377表达水平明显低于PR组、CR组、对照组(P<0.05),说明miR-377低表达水平可使患者更不易治愈,进而可影响患者预后。本研究生存分析发现,miR-377高表达组总生存率明显高于miR-377低表达组(P<0.05),多因素Cox回归模型分析结果显示,miR-377是影响急性淋巴细胞白血病患者预后的危险因素(P<0.05),进一步证实miR-377表达水平与急性淋巴细胞白血病预后密切相关,临床可通过检测miR-377表达水平及时评估患者预后状况,从而为提高临床疗效提供参考依据。既往研究显示,miR-377在胶质瘤中表达失调,且上调miR-377可显著抑制胶质瘤细胞增殖与侵袭[15]。因此miR-377表达下调可促进急性淋巴细胞白血病患者细胞增殖,进而影响治疗效果及预后。

SMYD3属于SET和MYND结构域蛋白家族成员之一,具有通过催化H3K4甲基化调控基因表达的作用,并且在多种恶性肿瘤中发挥重要的调控作用[16-17]。本研究结果显示,观察组SMYD3表达水平高于对照组(P<0.05),提示SMYD3可能参与疾病发生,与刘方[18]研究结果一致。另外本研究发现,SSMYD3高表达组患者的危险度分型,WBC(入院时、入院1月后),LDH(入院时、入院1月后),骨髓原幼细胞比例均明显高于SMYD3低表达组(P<0.05)。既往研究发现,SMYD表达水平降低可导致癌细胞迁移和侵袭受到明显抑制[19],说明SMYD高表达可使病情加重,参与疾病进展。本研究结果显示,NR组SMYD3表达水平明显高于PR组、CR组、对照组(P<0.05),说明SMYD表达与临床疗效有关。生存分析发现,SMYD3高表达组总生存率明显低于SMYD3低表达组(P<0.05),提示SMYD3表达水平可为患者预后的预测提供参考。多因素Cox回归模型分析显示,SMYD3是影响急性淋巴细胞白血病患者预后的危险因素(P<0.05),证实SMYD3高表达参与患者病情进展及预后。既往研究发现,SMYD3高表达上皮性卵巢癌患者的中位生存期更低[20]。可能是由于SMYD3可通过活化下游癌基因,导致肿瘤的发生和发展,当SMYD3表达上调时能够影响下游癌基因、细胞周期调控基因、信号转导相关基因,进而导致肿瘤细胞增殖增加,因此促使患者预后不良。

综上所述,急性淋巴细胞白血病患者miR-377呈低表达水平,SMYD3呈高表达水平,且其表达水平与患者临床特征、疗效及预后生存率均密切相关,因此可作为评估患者临床预后的有效指标。但是由于本次研究为单中心分析,因此在今后研究中可需加大样本量进一步分析miR-377、SMYD3在急性淋巴细胞白血病患者中的作用机制,以期为临床治疗提供实验依据。