陈举海,许逢燕,张书萍,王明栋,金 欣,莫显刚△

1.贵州医科大学临床医学院,贵州贵阳 550004;2.贵阳市公共卫生救治中心内三科,贵州贵阳 550004;3.贵州医科大学附属医院综合病房,贵州贵阳 550004

动脉粥样硬化(AS)是心血管事件发生的主要因素[1],其发病机制尚未完全阐明。AS作为一种慢性血管炎症性疾病[1],单核细胞在其发生发展中起着关键作用,单核细胞相关基因可能是识别AS的关键[2]。利用生物信息学方法识别差异表达基因可用于诊断疾病[3]。本研究前期从GEO数据库的GSE23746数据集下载颈AS(CAS)转录组数据,于MsigDB数据库下载单核细胞相关基因,利用生物信息学方法筛选出5个单核细胞相关差异表达基因[高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、趋化因子(C-C-基元)配体3(CCL3)、趋化因子(C-C-基元)配体3样蛋白1(CCL3L1)、趋化因子(C-C-基元)配体4(CCL4)和双特异性磷酸酶1(DUSP1)]作为CAS的特征基因。为进一步探索CAS的诊断生物标志物,本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证上述特征基因的表达谱,并进行了蛋白互作分析(PPI)调控网络、转录因子(TFs)调控网络及竞争性内源RNA(ceRNA)网络的探索,为CAS的机制研究提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 特征基因表达验证试验采用病例对照研究方法,选取2021年1-12月在贵阳市公共卫生救治中心经颈动脉彩超确诊CAS患者20例作为CAS组,其中男10例,女10例;年龄(52.10±3.82)岁;体质量指数(22.26±1.37)kg/m2;舒张压(77.40±7.71)mmHg;收缩压(129.10±7.63)mmHg。同期招募了20例无CAS的健康志愿者作为对照组,其中男10例,女10例;年龄(49.80±4.86)岁;体质量指数(21.36±1.21)kg/m2;舒张压(70.40±9.25)mmHg;收缩压(121.80±9.46)mmHg。两组基线资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。参加试验受试者均需签署知情同意书,本研究获得贵阳市公共卫生救治中心伦理委员会审查通过[批件号:2021伦审第(202151)号]。CAS组纳入标准:(1)年龄40～60周岁;(2)体质量指数为18.5～24.9 kg/m2;(3)颈动脉彩超提示CAS斑块形成;(4)血常规、肝肾功能、血脂、血糖及血压无显著异常。排除标准:有急慢性感染、血液系统疾病、免疫系统疾病、严重心肺功能不全、近期手术或创伤、肿瘤等相关疾病者。

对照组纳入标准:(1)年龄40～60周岁;(2)体质量指数为18.5～24.9 kg/m2;(3)颈动脉彩超无异常;(4)血常规、肝肾功能、血脂、血糖及血压正常。排除标准:(1)有AS家族史、吸烟、饮酒者;(2)有急慢性感染、血液系统疾病、免疫系统疾病、严重心肺功能不全、近期手术或创伤、肿瘤等相关疾病者。

1.2仪器与试剂 紫外分光光度计(752)(上海菁华科技仪器有限公司)、核酸电泳装置(北京市六一仪器厂)、2720 Thermal Cycler 普通PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、CFX96实时定量荧光PCR仪(美国Bio-Rad公司)、SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit(美国GeneCopoeia公司)、BlazeTaqTMSYBR®Green qPCR Mix 2.0(美国GeneCopoeia公司)、Nuclezol LS RNA Isolation Reagent(美国ABP Biosciences公司)、引物(北京擎科生物科技股份有限公司)、无RNase水(北诺博莱科技公司)、TAE缓冲液(北京索莱宝生物科技有限公司)、DL2000 DNA Marker(日本Takara公司)、核酸染料(北京百泰克生物技术有限公司)、DEPC(美国AMRESCO公司)、EasySepTMHuman Monocyte Isolation Kit/EasySepTM人单核细胞分选试剂盒(加拿大STEMCELL Technologies公司)等。

1.3方法

1.3.1采集外周血样本及外周血单核细胞分离 采集所有受试者外周血标本10 mL,分离外周血单核细胞,取外周血单核细胞到15 mL离心管中,再向每1 mL细胞悬液中加入50 μL Isolation Cocktail试剂和50 μL RapidSpheresTM磁珠,常温孵育5 min,加入3倍于原始样品体积的PBS(无Mg2+、Ca2+),轻轻混匀。将流式管置于EasySepTM磁极中,常温孵育3 min,将得到的单核细胞液倒入崭新的离心管中,10 mL PBS清洗两遍,250×g离心10 min。弃上清即可得到外周血单核细胞。

1.3.2总RNA的提取 收集单核细胞,加1 mL TRIzol试剂充分裂解后,提取RNA沉淀并自然干燥,向干燥完成的RNA沉淀中加入30～50 μL的无RNase水,静置15 min,使RNA彻底溶解,取3 μL RNA用TAE缓冲液稀释到3 mL后上分光光度仪检测A260和A280,计算RNA纯度/浓度和下述步骤的上样量,剩余RNA立即进行逆转录或冻存于-80 ℃冰箱中。

1.3.3逆转录 mRNA的逆转录使用美国GeneCopoeia公司的SureScript-First-strand-cDNA-synthesis-kit试剂盒,按上样要求加入RNA及各个试剂和溶液至20 μL,按照下述条件在普通PCR仪上进行逆转录:25 ℃,5 min;42 ℃,45 min;85 ℃,5 min;4 ℃,终止。

1.3.4上机检测 先将上述逆转录产物cDNA稀释10倍(所有样品按照同一倍数进行稀释)再进行下述qRT-PCR。mRNA的qRT-PCR反应检测使用广州Genecopoeia公司的BlazeTaqTMSYBR®Green qPCR Mix 2.0试剂盒,按顺序及上样要求加入试剂至 10 μL。短暂离心后,按下列条件在CFX96实时定量荧光PCR仪进行20～40个循环的反应:预变性95 ℃,30 s;变性95 ℃,10 s;退火60 ℃,20 s;延伸72 ℃,30 s。采集记录荧光,制作扩增曲线和溶解曲线,读取Ct值。相关引物由擎科生物公司合成,引物序列见表1。

表1 特征基因引物序列

1.3.5结果分析 读取Ct值后,用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量,具体为:第一步计算ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔΔCt=ΔCt(CAS组)-ΔCt(对照组);最后计算2-ΔΔCt值,用Graphpad Prism 6计算P值。

1.3.6特征基因的PPI调控网络探索、TFs调控网络和ceRNA机制探索 本研究使用STRING(https://www.string-db.org/)对CAS组与对照组的特征基因进行PPI。使用NetworkAnalyst (http://www.networkanalyst.ca)中的ChIP-seq数据,ENCODE数据库预测了特征基因的潜在TFs。使用miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)数据库完成基于特征基因的ceRNA机制预测。具体来说,从miRWalk数据库中预测靶向特征基因的微小RNA(miRNA),从StarBase数据库中预测靶向特征基因的miRNA和长链非编码RNA(lncRNA)关系对。

2 结 果

2.1特征基因mRNA的相对表达量 与对照组比较,HMGB1 mRNA相对表达量在CAS组中高表达(P<0.05),CCL3、CCL3L1、CCL4和DUSP1 mRNA相对表达量在CAS组中均低表达(P<0.01)。见表2。

表2 特征基因mRNA相对表达量对比

2.2特征基因的TFs调控网络及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络探索 本研究使用NetworkAnalysis来预测5个特征基因的TFs,结果CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1均预测到TFs,但CCL3L1没有预测到TFs。通过NetworkAnalyst在线平台和R包Cytoscape构建一个包含142个TFs和4个特征基因的网络(CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1)。具体来说,9个TFs与CCL3相关;5个TFs与CCL4相关;129个TFs与DUSP1相关;12个TFs与HMGB1相关。在这些TFs中,EBF1是CCL3、CCL4和DUSP1共享的TF;CEBPB是CCL3和DUSP1共享的TF;NFIC和SUPT5H是CCL3和CCL4共享的TF;MAZ、GTF2F1、WRNIP1、RAD21、ZFX、SMAD5、MYNN和ZNF501是DUSP1和HMGB1共享的TFs。见图1。

图1 特征基因的TFs调控网络

本研究基于miRWalk和 StarBase数据库完成了基于特征基因的ceRNA机制预测,本网络包含66个miRNA、39个lncRNA,其中85个mRNA和lncRNA以4个特征基因(CCL3、CCL4、DUSP1和HMGB1)为中心。CCL3共存在23种ceRNA机制(16个lncRNA通过竞争性结合23个miRNA调控CCL3表达);CCL4共存在17种ceRNA机制(12种lncRNA与17种miRNA结合);DUSP1共存在20种ceRNA机制(18个lncRNA与20个miRNA竞争性结合可调控DUSP1的表达;HMGB1共有25个ceRNA机制(25个miRNA可以被6个lncRNA竞争性结合DUSP1的表达)。lncRNA AL109811.1与hsa-miR-134竞争性结合,以及lncRNA AL358472.3与hsa-miR-887-3p竞争性结合均可调控CCL4和DUSP1;lncRNA AL391244.1与hsa-miR-151b和hsa-miR-151a-5p竞争性结合可调控CCL3和DUSP1的表达;hsa-miR-1914-3p与lncRNA MIR34AHG竞争性结合可调控CCL3和CCL4的表达。见图2。

图2 特征基因lncRNA-miRNA-mRNA调控网络

3 讨 论

CAS是一种临床常见病,对其机制研究一直备受关注。近年来,有研究发现,单核细胞相关基因可作为识别有心力衰竭风险的急性心肌梗死的诊断标志物[3]。由于单核细胞与CAS的发生发展密切相关,故单核细胞相关基因也有作为CAS特征基因的潜力,但相关研究较少,故本研究分析单核细胞相关基因探索CAS发病的分子机制,以期为CAS的诊治研究提供重要线索。

本课题组前期通过对GSE23746数据集的转录组数据进行生物信息学分析,筛选出5个单核细胞相关差异表达基因(CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1和HMGB1)作为CAS的特征基因。其中,CCL3作为CCR5的趋化因子配体,有研究发现,将CCL3缺失的骨髓移植到LDLR缺失的小鼠体内,可抑制AS进展[4]。CCL4在AS患者中水平升高,而抑制CCL4可稳定AS并减少内皮细胞和巨噬细胞的激活[5]。趋化因子及其受体是AS病变炎症环境中的重要效应因子,CCL3和CCL4作为CCR5的趋化因子配体,在AS斑块中表达上调[6]。CCL3L1是CCL3的亚型,其在许多炎症反应中发挥重要作用,包括巨噬细胞和T细胞依赖的免疫反应[7],而CCL3已知与AS的发生发展有着密切关系[4],但目前CCL3L1与AS之间相关性的研究较少。DUSP1/丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶(MKP-1)是一种核酶,MKP-1是控制单核细胞黏附和趋化MAPK通路的反调控因子,单核细胞和巨噬细胞中的DUSP1缺失通过影响巨噬细胞自噬、增强凋亡、调节巨噬细胞极化失调来加速AS的发生[8]。HMGB1是一种DNA结合蛋白,可促进AS的发展,血清HMGB1水平是2型糖尿病患者颈动脉斑块易感性的独立危险因素[9]。研究表明,氧化低密度脂蛋白可上调HMGB1在人脐静脉内皮细胞中的表达,而下调HMGB1表达可预防氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞损伤,HMGB1通过介导内皮细胞损伤参与AS的发生及病变的进展[10]。目前越来越多的研究采用生物信息学分析筛选差异表达基因作为某些疾病的诊断标志物,而本研究发现的这组差异表达的单核细胞相关基因未来或许可作为CAS的生物标志物,但仍需未来的基础及临床研究进行证实。

研究表明,TFs的改变可影响血管病理生理变化[11]。故本研究使用NetworkAnalysy预测了5个特征基因的TFs,结果显示,CCL4、CCL3、DUSP1和HMGB1均预测到TFs,其中EBF1是CCL3、CCL4和DUSP1共享的TF;CEBPB是CCL3和DUSP1共享的TF;NFIC和SUPT5H是CCL3和CCL4共享的TF;MAZ、GTF2F1、WRNIP1、RAD21、ZFX、SMAD5、MYNN和ZNF501是DUSP1和HMGB1共享的TFs。YAMADA等[12]的研究发现,EBF1在AS斑块中存在明显低甲基化,这些低甲基化基因的过表达可能导致各种AS相关基因的表达发生明显变化。CEBPD可促进血管病变处M1巨噬细胞内脂质积累[13]。对TF及其相互作用因子的功能研究对了解它们在信号级联反应中的作用至关重要,可为CAS的基础研究及生产应用提供理论依据。除此之外,有证据表明,miRNA和lncRNA参与了人类许多病理生理过程,包括AS[14-15]。故本研究在miRWalk和StarBase数据库的基础上,构建了一个ceRNA网络,结果发现,lncRNA AL109811.1-hsa-miR-134和lncRNA AL358472.3-hsa-miR-887-3p竞争性结合均可调控CCL4和DUSP1的表达;lncRNA AL391244.1通过竞争性结合hsa-miR-151b和hsa-miR-151a-5p可调控CCL3和DUSP1的表达;hsa-miR-1914-3p与lncRNA MIR34AHG竞争性结合,可调控CCL3和CCL4的表达。关于上述ceRNA调控网络的研究较少,但这为未来进行CAS的相关机制研究提供了一定思路。

上述研究表明,通过生物信息学分析筛选出的5个基因参与了AS的病理生理过程[4-10]。笔者前期研究采用套索算法和支持向量机递归特征消除算法等生物信息学分析方法对GSE23746数据集下载的CAS转录组数据和MsigDB数据库下载单核细胞相关基因数据进行分析,最终筛选出的5个差异表达的单核细胞相关基因中有4个(CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1)在CAS组中呈现出mRNA相对表达量下调,仅HMGB1 mRNA相对表达量上调[16]。为了证实生物信息学分析的结果,本研究收集了CAS组和对照组外周血单核细胞进行qRT-PCR验证,结果保持一致。李戈锐等[17]的研究也发现,在CAS和冠状动脉粥样硬化患者与健康者的外周血单核细胞中分别筛选出16个和153个差异表达基因,且其表达均显著下调,其中包括CCL3L1、CCL4,可能提示外周血单核细胞的炎症信号受到抑制。然而这与既往研究显示的促炎因子(如CCL3、CCL4)在AS斑块中呈高表达的结论不一致[6]。针对外周单核细胞中CCL3、CCL4等基因与动脉粥样硬化斑块中表达不一致的这一现象,有研究提出,在AS患者的动脉中,巨噬细胞的炎症反应呈过度激活,而机体可能存在负反馈机制来抑制外周血单核细胞的炎症反应[18]。除此之外,有学者研究了人外周血和自体动脉粥样硬化斑块的趋化因子基因表达谱,结果显示CCL2、CCL3和CCL4在外周血中低表达,在自体动脉粥样硬化斑块中高表达[19]。虽然有上述的解释和推测,但仍缺乏直接的令人信服的证据。本研究所有数据均基于基因mRNA的相对表达量,未进行蛋白水平的检测及分子机制的探索。鉴于此,未来可能需要更多的体内外实验对其机制进行研究。

综上所述,CCL4、CCL3、CCL3L1、DUSP1和HMGB1组成的5个单核细胞差异表达基因可作为CAS的特征基因,但仍需未来进一步的机制探索和分子验证加以证实。