【摘要】为筛选出对小麦赤霉菌有拮抗作用的生防放线菌，本文采用平板画线法、对峙法等进行放线菌的筛选。根据对小麦赤霉菌的抑菌率大小选定最优抑菌效果的放线菌。放线菌液体培养基经摇瓶发酵、正交试验优化其培养基配料发酵条件，确定其发酵培养基的组成，并利用牛津杯法比较抑菌圈的直径平均值选择最优的组成比例。

【关键词】小麦赤霉菌；生防放线菌；抑菌圈；發酵优化；正交试验

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.05.030

Screening and Identification of Biocontrol Actinomycetes Against Wheat Scab and Optimization of Fermentation Conditions

JIN Keke

（Anhui Zhongqing Inspection and Testing Co.， Ltd.， Hefei 230088， China）

Abstract： In order to screen biocontrol actinomycetes that have antagonistic effects on wheat scab， this article uses plate drawing method， confrontation method， etc. to screen actinomycetes. Select the actinomycetes with the best antibacterial effect based on the antibacterial rate of biocontrol actinomycetes against wheat scab. The liquid culture medium of actinomycetes was subjected to shake flask fermentation and orthogonal experiments to optimize the fermentation conditions of the culture medium ingredients. Determine the composition of its fermentation medium and use the Oxford Cup method to compare the average diameter of the antibacterial zone to select the optimal composition ratio.

Key words： fusarium graminearum； biocontrol actinomycetes； antibacterial circle； fermentation optimization； orthogonal test

小麦赤霉病又称烂穗病、麦秸枯、烂麦头、红麦头、红头瘴。多发生在安徽西北部，因阴雨较多，导致小麦种植区域易发生小麦赤霉病。禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum Schw.）是小麦赤霉病的主要病原菌之一[1]。其发病率高，容易使小麦产量损失严重，每亩可减产10%～40%。大多小麦种植区都是以化学农药防御为主，效果不太显著，而且逐年加大农药使用会导致农药残留越来越多沉积在小麦中，不仅污染周围的健康环境，还增强了小麦赤霉病的抗药性。将微生物作用到农作物病害预防治疗上，不仅无环境污染、无农药残留、不增强病菌抗病性，还能达到预防病害的效果，因此微生物液体农药是目前农作物病虫害防治的主题。微生物的分离、纯化、筛选、发酵等研究将是微生物农药研究试验重点中的重点。筛选出抑制效果较好的放线菌，研究其发酵液的优化条件，制成有预防作用的微生物农药，将有利于小麦的生长和增产。放线菌培养基条件的优化和生物农药的研究将有待进一步的实验。

1材料和方法

1.1仪器设备

电子分析天平（YP30002，佑科仪器），立式压力蒸汽灭菌锅（YXQ-70A型，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），双人洁净工作台（OptiClean 1300），生化培养箱（LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司），格兰仕微波炉[P70D20P-TE（WO）型，格力公司]。

1.2材料和试剂

1.2.1小麦赤霉菌来源

皖西学院大别山植物内生真菌资源研究中心所保存的部分放线菌和小麦赤霉病病原菌。

1.2.2试剂、培养基

PDA培养基，高氏一号培养基。

1.3实验方法

1.3.1实验流程

实验流程见图1。

1.3.2小麦赤霉病病原菌和放线菌

将得到的小麦赤霉病病原菌接种到PDA培养基上进行菌种活化培养，供试放线菌接种到高氏1号培养基进行菌种活化培养（恒温恒湿培养箱28℃培养3 d）。培养出的菌落无异常后，分别进行菌种斜面保存。如果出现其他杂菌现象，重新培养、提纯、斜面保存，直到培养得到纯种菌。

1.3.3供试放线菌的抑菌筛选

1.3.3.1初筛

采用十字交叉对峙法[2]，在同一平板中涂上有拮抗作用的物质。若供试放线菌对小麦赤霉病病原菌有抑制作用，则培养基上的菌落无法完全重合，有一定的弧度，放线菌菌落周围会出现空白区域。无放线菌和小麦赤霉病病原菌生长，形成不能完全密封的空白区域。

使用微波炉加热灭过菌的PDA培养基至液体，冷却至55℃左右，在超净工作台面上，酒精灯火焰旁倒平板，静置冷却至固体；用接种环从1.3.2中活化后的小麦赤霉菌菌丝，沿着PDA培养基平板中点向两边的培养皿边缘划一个交叉的十字，把培养基均匀划分为四个区域；再用已灭菌的接种挑取适量大小的供试放线菌接种到培养基四个区域的边缘中间，用记号笔在培养皿的底部标记供试放线菌的编号，置于28℃培养箱中培养3～4 d。

1.3.3.2复筛

小麦赤霉病菌菌悬液。把1.3.2中活化的菌株，用接种环从斜面培养的菌落上取两环菌丝，放到装有无菌水容量为250 mL的锥形瓶中，摇晃均匀，使菌均匀的分散开。

放线菌对小麦赤霉病病原菌拮抗作用越大，周围抑菌圈越大。反之抑菌圈越小，拮抗作用越小，对小麦赤霉病病原菌的抑制效果越高。

挑取1.3.3.1初筛出有抑制作用的防线菌琼脂块，接种在涂布均匀小麦赤霉病病原菌的培养基正中，摆正放入30℃培养箱3 d，取出观察记录是否放线菌周围出现抑菌圈和抑菌圈的大小。

1.3.4优化实验

1.3.4.1放线菌摇液制备

将1.3.3.2复筛出的抑制圈直径最大的放线菌菌株活化后，接入高氏1号培养液中，固定于30℃，150 r/min恒温摇床摇5 d，备用。

1.3.4.2发酵培养基的选择

用移液枪接种1.3.4.1中放线菌液1 mL到锥形瓶内，30℃、150 r/min摇床培养5 d，重复3次。用牛津杯法做抑菌圈试验，测量抑菌圈直径。

1.3.4.3发酵条件的优化

通过正交试验获得最佳培养基[3]，用最佳培养基培养发酵放线菌，发酵放线菌发酵条件（包括初始pH、发酵温度、发酵时间）采用单一变量法优化，用抑菌圈直径表示，寻找最佳发酵条件。

2结果与分析

2.1纯化与保存结果

如下图2、图3所示，菌落质地致密，表面呈绒状、干燥、多皱，菌落较小。

2.2放线菌初步筛选的结果

根据上述初筛试验，从提供的供试放线菌中选出有抑制作用，扇形区域面积最大的三株供试放线菌，分别为放线菌281、放线菌105。如图4、图5所示，图片下方区域接种放线菌的地方有明显的一块扇形区域。105号放线菌对小麦赤霉菌具有抑制作用。

2.3供试放线菌对小麦赤霉菌二次筛选的结果

如图6、图7所示，抑菌结果相比较，可以看出对小麦赤霉菌抑制作用最明显的为67号放线菌。

2.4优化放线菌发酵条件结果

2.4.1优化选择发酵培养基配料结果

在配制供试的4种培养基中，2、3、4号培养基抑菌效果不明显（牛津杯抑菌圈法）。1号培养基抑菌圈直径平均值最大（见图8、图9）。因此选用1号培养基作为发酵培养基，配方为：黄豆粉、蛋白胨、葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO、CaCO3。

2.4.2放线菌发酵液条件优化结果

2.4.2.1培养基的配料对发酵的影响

正交試验采用黄豆粉（1.5%～3.5%，按1%递增）、蛋白胨（1%～1.5%，按0.5%递增）、葡萄糖（1%～1.5%，按0.5%递增）3个因素，每个因素3个水平所选的3种营养成分，对于放线菌67号菌株所产抑菌物质的影响大小程度依次为：蛋白胨﹥黄豆粉﹥葡萄糖。从实验结果分析出，最佳配方为：2.5%黄豆粉、2%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.5%CaCO3，见表1。

2.4.2.2培养时间对发酵的影响

如图10所示，发酵时间对发酵液产生抑菌物质有很大的影响。在24～60 h，随着时间的递增，抑菌圈大小逐渐增加，在60 h左右时，抑菌圈直径达到最大，之后逐渐下降，此时67号放线菌生成的抑菌物质达到最大。因此60 h为最优发酵培养时间。

2.4.2.3初始pH值对发酵液培养的影响

如图11所示。发酵液初始pH值设定在5.5～8.5之间，67号放线菌发酵液产生的抑菌圈在pH值5.5～7.5之间直径逐渐增大。在pH值为7.5左右抑菌圈为最大值，随后逐渐变小。所以7.5为发酵最优初始pH值。

2.4.2.4培养温度对发酵的影响

如图12所示，使用最佳培养基，确认其他变量不变，改变摇床内发酵液的环境温度，记录随时间变化抑菌圈的大小。在25～35℃之间，67号放线菌能产生的抑菌物质较多，30℃时放线菌抑菌圈直径达到最大。因此30℃为最佳发酵温度。

3结束语

本文通过对小麦赤霉病病原菌和放线菌分别进行纯化与保存，通过选择配方、培养时间、pH值，以及发酵温度优化条件得出最佳配方为：2.5%黄豆粉、2%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.05%MgSO4·7H2O、0.1%KH2PO4、0.5%CaCO3。60 h为最优发酵培养时间，7.5为发酵最优初始pH值，30℃为最佳发酵温度，筛选鉴定及发酵条件优化出67号放线菌，为后期解决放线菌对小麦赤霉菌的抑菌作用、放线菌抑菌因素、微生物农药的制备因素提供基础。

【参考文献】

[1]全國小麦赤霉病研究协作组.我国小麦赤霉病穗部镰刀菌种类、分布及致病性[J].上海师范大学学报，1984（3）：69-82.

[2]陆凡，陈志谊，刘永锋，等.拮抗细菌处理稻种对水稻恶苗病的防治效果及对水稻产量形成的影响[J].中国生物防治，1999，15（2）：59-61.

[3]孙会强，周赛男，谭周进，等.一株烟草内生拮抗放线菌发酵条件优化[J].应用与环境生物学报，2011，17（6）：914-917.

【作者简介】

靳苛苛，女，1991年出生，助理工程师，学士，研究方向为检验检测。

（编辑：李加鹏）