李娜 刘孜 李哲 赵蓝青青 熊辉

原发性痛经(primary dysmenorrhea,PD)是指生殖器官无器质性病变的痛经,常见行经前或月经期出现下腹疼痛、坠胀,伴腰酸或其他不适,程度较重可致影响生活和工作[1]。白芍为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根,微寒,味苦、酸,具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等功效。白芍化学成分丰富,主要包括萜类类、黄酮类、鞣质类等。程天缘[2]等人通过中医传承辅助平台中的“方剂分析”功能,经过筛选与总结,得到治疗痛经的中成药配方中常用中药10味,其中白芍排在第四位。《本草正义》记载“补血,益肝脾真阴,而收摄脾气之散乱,肝气之恣横,则白芍也”“故益阴养血,滋润肝脾,皆用白芍”,说明白芍正是治疗痛经的首选中药。白芍药效的发挥与其质量密切相关,现行白芍质控指标主要定位在芍药苷,指标单一,且与有效性和安全性关联性差,无法有效控制白芍质量[3]。因此本研究拟采用UPLC-Q-TOF-MS对白芍中的化学成分进行系统表征,联合网络药理学方法和质量标志物的理论,对白芍的质量标志物进行预测。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

SOIENTZ-18N型冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Triple TOFTM5600质谱仪(美国AB SCIEX公司);ExionLCTM型超高效液相色谱仪(美国AB SCIEX公司);Analsyt TF 1.6软件(美国AB SCIEX公司);CPA225D型电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);白芍饮片购自河北荷花池药业有限公司(批号:C2232012004),经承德医学院苏占辉教授鉴定为毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根;屈臣氏饮用水(广州屈臣氏食品饮料有限公司);甲酸(赛默飞世尔科技(中国)有限公司);乙腈(美国Fisher公司);甲醇(德国Merck公司)。

1.2 供试品的制备

取白芍饮片粉末0.1 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇5 mL,称定重量,超声处理(800 W,40 kHZ)30分钟,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足重量,13000 r/min 4℃离心10分钟,取上清液过0.22 μm有机滤膜,即为供试品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC®HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 μm );流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱见表1;进样量3 μL;柱温:30 ℃。

表1 色谱条件

1.4 质谱条件

离子源为ESI源,采用正负离子化模式检测:正负离子模式喷雾电压为5.5 kV/-4.5 kV,裂解电压为100 V/-100 V,碰撞能35 eV/-35 eV,雾化气55 psi,辅助气55 psi,气帘气35 psi。数据采用一级和二级结合的扫描模式(MS/MS2),质量范围均为m/z50～1200,裂解电压100 V/-100 V,离子源温度为550 ℃,仪器每隔2小时校正一次质量轴。

1.5 化学成分鉴定

使用MarkerView软件将质谱原始导入。进行保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐等工作,同时创建复方中相应中药代谢库,利用标准品二级质谱数据库(HMDB、Massbank等)、参考文献及相应裂解规律匹配法对含有MSMS数据的峰进行物质鉴定。

1.6 网络药理学分析

1.6.1 白芍成分作用靶点预测 将鉴定得到的化合物根据OB≥20%或者DL≥0.1筛选出活性成分。在TCMSP中搜索成分,得到对应的相关靶点。未在TCMSP数据库记录靶点的化合物,通过PubChem搜索得到SMILE号,使用SMILE号在Swiss Target Prediction预测相关靶点。

1.6.2 疾病靶点筛选 在Therapeuic Tarrget Database数据库与Comparative Toxicogenomics Database数据库中搜索“primary dysmenorrhea”,将得到的疾病靶点取并集,作为疾病靶点。

1.6.3 蛋白相互作用网络构建 将交集靶点导入String数据库中,进行蛋白—蛋白相互作用网络分析,并导出数据。将数据导入Cytoscape 3.9.1软件,获得PPI网络图,计算节点连接数degree,筛选出大于双倍平均值作为核心靶点。

1.6.4 GO和KEGG通路富集 将核心靶点导入DAVID数据库,进行白芍治疗原发性痛经的基因本体论(gene ontology,GO)与KEGG通路富集分析。筛选条件为FDR≤0.01和P-Value≤0.05。将数据按照counts降序排序,分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)、细胞组分(cell components,CC)分别取前10,KEGG通路取前20,作为分析对象,并进行可视化绘图。

1.6.5 候选质量标志物与核心靶点分子对接分析 利用Cytoscape在“成分—靶点—疾病网络图”中选择Degree值高的活性成分作为候选质量标志物,与核心靶点进行分析对接。从PubChem数据库中下载候选质量标志物小分子SDF格式文件,使用Chem3D软件将SDF文件转化为mol文件。从PDB数据库获得核心靶点的蛋白结构。运用AutoDockTools1.5.6软件对蛋白结构进行优化,找到蛋白活性口袋。使用AutoDock Vina和Python脚本进行分子对接,得到结果数据。在Protein-Ligand Interaction Profiler网站进行验证。然后使用PyMOL对小分子和蛋白结合模式进行可视化,并分析关键结合位点。

2 结果

2.1 基于UPLC-QTOF-MS/MS的白芍化学成分识别

共鉴定得到64种化合物(表2和表3),在PeakView软件中导出基峰色谱图(如图1,图2),将64个化合物标在相应位置上。这些化合物主要包括有机酸类、单萜苷类、黄酮类化合物等。有机酸类化合物有柠檬酸、丹皮酚等。单萜类化合物主要有芍药内酯苷、牡丹皮苷F、羟基芍药苷、芍药苷亚硫酸酯等。黄酮类有柚皮素、儿茶素、表儿茶素,鞣质有没食子酸、没食子酸乙酯等。以芍药内酯苷为例进行成分表征阐述,如图2,二级质谱有m/z77.0387、m/z121.0284、m/z283.0817、m/z479.1542四个峰。根据参考文献推断,m/z479.1542为[M-H]-准分子离子峰,特征离子峰m/z283为[M-H-CO2-C7H5O2]-,其中CO2为内酯环断裂失去酯基,m/z121.0287是分子源内裂解形成的苯甲酸负离子。

图1 在正负离子模式下采集白芍饮片的基峰色谱图

图2 在负离子模式下推断的芍药内酯苷二级裂解机制

表2 负离子模式下鉴定白芍饮片的化学成分信息

表3 正离子模式下鉴定的白芍化学成分信息

2.2 活性成分靶点与疾病靶点预测

筛选得到活性成分36个,在TCMSP与Swiss Target Prediction数据库检索到对应的靶点697个。Therapeuic Tarrget Database与Comparative Toxicogenomics Database数据库搜索到疾病靶点1693个。共有靶点去除重复后结果表明,36个有效成分与原发性痛经有共同靶基因76 个。将白芍活性成分、原发性痛经及其共同靶点导入Cytoscape进行可视化得到成分—靶点—疾病网络图(图3)。结果表明,同一个化合物分子可以对应多个靶标,一个靶标基因亦对应多个化合物,体现了白芍多成分、多靶点和多通路的作用机制。

2.3 蛋白相互作用网络构建

利用String数据库获得各个核心靶点的Degree值,并进行排序,筛选得到核心靶点10个(图4),包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、雌激素受体1(estrogen receptor1,ESR1)、前列腺素内过氧化物酶合酶2(prostaglandin-endoperoxidase synthase 2,PTGS2)、Bcl-2样蛋白1(Bcl-2-like protein 1,BCL2L1)、热休克蛋白90α(heat shock protein HSP 90-alpha,HSP90AA1)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)、信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)使用Cytoscape将蛋白互作网络进行可视化(图5)。

图4 基于String数据库获得的核心靶点Degree排序条状图

图5 基于Cytoscape软件绘制76个核心蛋白靶点互作网络和Degree热图

2.4 GO分类富集分析

将蛋白靶点互作网络中的76靶点蛋白靶点导入DAVID数据库,导出通路分析结果,筛选FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,得到BP 55条,CC 16条,MF 19条。根据Counts值分别取前10条进行GO分析(图6)。

图6 基于76个核心靶点富集的排名前10的GO富集分析气泡图

2.5 KEGG通路分析

在DAVID数据库导出结果中,按照counts进行排序,筛选FDR≤0.01,且PValue≤0.05的通路,选取前20条进行分析,结果如图7。包括15条通路与人类疾病相关,有癌症通路、心血管疾病、神经变性疾病、病毒性传染病、细菌性传染病、内分泌和代谢性疾病相同通路;4条为环境信息处理类,参与信号转导,包括磷脂酰肌醇三羟基激酶—苏氨酸激酶(phosphoInositide-3 kinase-protein kinase B,PI3K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、低氧诱导因子1(hypoxia induced factor 1,HIF-1)的信号通路;1条为免疫系统相关,是白细胞介素17(interleukin 17,IL-17)信号通路。

图7 基于76个核心靶点富集的排名前20的KEGG通路气泡图

2.6 分子对接

选择6个核心靶点蛋白BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、STAT3、PPARG、VEGFA与对应的4个活性成分(柚皮素、牡丹皮苷I、芍药内酯苷、芍药内酯C)进行分子对接。一般认为结合能<-5 kcal/mol的对接结果较为理想,对接结果均满足要求,结合位点视图如图7。小分子多用非共价键相互作用与蛋白连接,包括氢键、离子键与π-π堆积作用。如牡丹皮苷I与HSP90AA1的分子对接(图8 K),有平行π-π堆积作用(PHE-138)、垂直的π-π堆积作用(TRP-162)以及5个氢键连接位点(ASN-51、ASN-51、ASP-54、LYS-58、GLY-135)和疏水相互作用(VAL-150)。芍药内酯苷通过离子键(ARG-143)与MMP9的连接(图8B)。

注:A 柚皮素-BCL2L1;B 牡丹皮苷I-HSP90AA1;C 芍药内酯苷-HSP90AA1;D 牡丹皮苷I-MMP9;E 芍药内酯苷-MMP9;F 芍药内酯C-MMP9;G 芍药内酯C-STAT3;H 柚皮素-PPARG;I 柚皮素-VEGFA;J 牡丹皮苷I-VEGFA;K 芍药内酯苷-VEGFA图8 活性成分与核心靶点分子对接结合能<-5 kcal/mol的各个对接可视化图

3 讨论

本实验联合UPLC-Q-TOF-MS与网络药理学技术对白芍治疗原发性痛经的质量标志物进行探究。首先利用液质联用技术共鉴定出62种化学成分,筛选出活性成分36个。在“白芍—成分—靶点—疾病”网路图中,筛选出高degree值作为关键成分,包括芍药内酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍药内酯C。Liu等[4]发现芍药内酯苷对神经病理性疼痛大鼠具有镇痛作用,其机制可能与调控中枢核苷酸结合寡聚结构域,富含亮氨酸重复序列和含1个Pyrin结构域(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)和核苷酸结合寡聚结构域,富含亮氨酸重复序列和含Pyrin结构域3(nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1,NLRP1)炎症小体活性以及抑制脊髓胶质细胞激活降低白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)水平有关。柚皮素来源丰富,药理作用广泛。Arora等[5]研究柚皮素对慢性睡眠剥夺诱导的小鼠机械和热痛觉过敏的影响,发现柚皮素对抗痛觉过敏反应的同时降低氧化应激和炎症因子的表达水平。Kim等[6]发现芍药甘草汤中治疗神经性疼痛的有效成分包括芍药内酯C、丹皮酚和苯甲酸等,其发挥作用的机制与调节亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢等途径有关。牡丹皮苷I目前尚无药理学研究和报道,但从本实验可以看出与核心靶点亲合力强。从以上文献调研可以看出芍药内酯苷、牡丹皮苷I、柚皮素和芍药内酯C对原发性痛经具有潜在的止痛效应。

通过蛋白互作网络分析获得6个核心靶点,包括BCL2L1、HSP90AA1、MMP9、PPARG、STAT3、VEGFA。将这些核心靶点进行KEGG通路富集分析,涉及PI3K-Akt、MAPK、TNF、HIF-1、IL-17等信号通路。IL-17和TNF信号通路被认为是炎症反应的关键通路,在类风湿关节炎动物模型中发现关节内注射IL-17可增加TNF-α、IL-1β的表达,诱导痛觉反应发生[7]。MMP9参与IL-17与TNF信号通路的调节,推测白芍可能通过调节体炎症因子的表达,抑制炎症反应,从而起到缓解痛经的作用。PI3K/Akt信号通路是调节细胞增殖和凋亡的重要通路,该通路中的PI3K、Akt以磷酸化的形式发生激活后能够对凋亡调节因子BAX(apoptosis regulator BAX,Bax)、Bcl-2相关细胞死亡激动剂(Bcl-2 associated agonist of cell death,Bad)等促凋亡基因的表达产生抑制作用而促进Bcl-2等相关抗凋亡基因的表达。而当缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于细胞时,PI3K/Akt通路受到抑制并使其抗凋亡作用减弱。Pi等[8]研究发现在小鼠心脏手术期间,异氟醚通过PI3K/Akt信号通路减轻疼痛并抑制小鼠心肌细胞凋亡,提示激活PI3K/Akt信号通路,可能缓解疼痛。也有研究显示单神经病理性疼痛的早期发展阶段MAPK信号通路发挥重要作用,一旦被激活会介导TNF-α引发痛觉效应[9]。有报道激活HIF-1信号通路可减少神经病理性疼痛中的机械性痛觉反应行为,其通路上的关键靶点VEGFA,可特异性地作用于内皮细胞,诱导内皮细胞生长,促进细胞迁移和抑制细胞凋亡[10]。实验研究发现原发性痛经患者子宫内膜VEGFA的表达显著高于正常女性子宫内膜的表达[11],说明我们筛选出的靶点的可信度较高。STAT3是一种转录激活因子,STAT3能与HIF-1α结合促进炎症因子的释放,研究发现STAT3的激活有效减轻大鼠神经病理性疼痛和炎症反应[12]。HSP90AA1属于HSP家族的HSP90亚家族,是最重要的热休克蛋白之一,在免疫和炎症中发挥重要作用。PPARG是一种配体依赖的核转录因子,可通过调节IL-17和TNF信号通路参与免疫炎症反应调控机体的生理和病理过程[13]。将6个核心靶点与其对应的4个活性成分进行分子对接。我们发现对接结果均符合结合能<-5 kal/mol,可认为亲和力较强。

质量标志物需要满足复方配伍、质量传递与溯源、特有性、有效性、可测性的五原则。芍药内酯苷是芍药属植物主要的单萜类,就目前所知仅分布于芍药属植物,因此是芍药属特征性化学成分。芍药内酯C是来自芍药的薄荷烷类似物,也属于白芍特有成分,满足特有性原则。曾洁等[14]利用高效液相色谱—质谱联用方法建立测定大鼠血浆中芍药内酯苷含量的分析方法,发现芍药内酯苷在大鼠体内能够被迅速吸收。另有中药复方的药动学研究发现,白芍与当归配伍可以显著增加芍药内酯苷的达峰时间以及末端消除半衰期,延长其在体内的滞留时间[15],证明芍药内酯苷能有效传递至血液中,满足传递性原则。而牡丹皮苷I和柚皮素来源丰富,特有性较差,不适合作为质量标志物。结合芍药内酯苷、芍药内酯C的化学结构分析可知有紫外吸收,推测其可用于定性定量分析。综上所述,我们认为芍药内酯苷、芍药内酯C可作为白芍的质量标志物。

本项目以辨识白芍治疗原发性痛经的定向药效质量标志物为主要研究目标,综合采用UPLC-Q-TOF-MS和网络药理学技术探究白芍化学物质基础及其作用机制,锁定白芍治疗原发性痛经定向功效的质量标志物,包括芍药内酯C、芍药内酯苷,为基于定向功效的白芍质量有效性评价提供科学依据。