陆维 陈亮 姜玉新 陆志伟

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)的主要特征是肺血管重塑,从而导致动脉管腔变窄,肺血管阻力增加,肺动脉压升高,最终右心衰竭甚至死亡。肺动脉内皮细胞,肺动脉平滑肌细胞,成纤维细胞,免疫系统失调及血管生成受损等因素参与肺血管重塑[1]。PAH目前病因不明,可能与遗传突变、表观遗传、环境因素,免疫炎症等相关,目前对PAH的发病机制的研究已经取得了显著进展。

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)因其在疾病中的作用,已经成为越来越令人感兴趣的领域。ncRNA中的一个亚组,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),内源性表达缺乏蛋白编码能力的RNA,这些RNA在一系列病理生理过程中发挥重要作用,譬如调节细胞活动(增殖、迁徙、凋亡、血管新生、新陈代谢),炎症反应和免疫应答和血管新生[2]。根据lncRNA在蛋白质编码区域附近的基因组位置,lncRNA被分为5类:正义,反义,内含子,基因间和双向作用lncRNA[3]。然而,非编码RNA并非完全不参与编码,现已发现lncRNA可参与编码蛋白质或多肽[4],这些功能肽可能成为抗癌治疗的靶点或预后的标记物。近年来,大量研究表明其在PAH发病机制中参与细胞差异表达。本文将综述lncRNA在PAH病理生理中的作用,并阐述其在PAH诊断及治疗中的作用及面临的挑战。

一、LncRNA在PAH中的作用机制

肺动脉血管重塑是PAH的重要机制,肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的过度增殖和凋亡抵抗可导致肺血管重塑。PASMC的功能障碍可由不同的信号通路介导,包括:PDGF,TGF-β,Wnt,雌激素,Notch,PI3K/AKT/mTOR 和 MAPK等。目前大部分lncRNA的研究都集中在PAH发展过程中对PASMCs及肺动脉血管内皮细胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)的调节作用。

1 H19

LncRNA H19是一种高度保守lncRNA,在胚胎形成过程中,在许多胎儿组织和在胚胎本身中高表达,但H19出生后在除了心脏和骨骼肌中以外的组织中下调[5]。近来,一些研究揭示了H19在PAH发病机制中的调节作用,其表达水平在野百合碱(MCT)诱导的PAH兔子和小鼠模型的血液和肺中均有升高,此外,已证明PDGF,IL-1β和 IL-6可以诱导产生H19,且可以通过PDGF-BB/H19/let-7b信号轴调节1型血管紧张素II受体促进PASMC细胞增殖[6]。而对小鼠模型中H19进行敲降,则对MCT诱导的PAH临床特征(右室肥大,肺血管中膜厚度和血管肌化等)表现出保护作用,表明H19可能是PAH的一个潜在治疗靶点。但是有研究则得出不同的结论,Wang等最近的研究表明,MCT诱导的PAH大鼠的H19,PDCD4和miR-675-3p水平显著降低,而IGF1R 和 miR-200α的表达水平增高,并证明了褪黑素可通过调节H19/miR-200α/PDCD4 和H19/miR-675-3p/IGF1R信号轴,抑制PASMCs 增殖,对PAH起保护作用[7]。故此,H19在肺血管重塑的作用方向尚不明确,仍需要更多在人类PAH样本中的研究。

2 CASC2

癌症易感性候选者2(Cancer Susceptibility Candidate 2,CASC2)是一种肿瘤抑制基因,已被研究证明通过不同的机制调节细胞增殖、迁移、侵袭、转移和血管生成。Gong等研究表明CASC2的表达水平在缺氧诱导的大鼠PAH模型的PA中和人PASMCs(HPASMCs)中明显降低,且无论体内和体外,CASC2过表达都可以抑制细胞增殖和迁移,并促进凋亡。此外,CASC2过表达可通过降低缺氧诱导的表型切换相关标记物α-SMA的表达。CASC2过表达可以改善缺氧诱导的大鼠的肺动脉高压的表现如:平均肺动脉压,RV肥厚,肺血管内壁增厚和纤维化等[8]。另一项体外研究表明,CASC2可通过调节miR-222/ING5轴减弱缺氧诱导的HPASMC的增殖和迁移,表明CASC2可能作为抑制PAH中的血管重塑的一个靶点[9]。

3 TUG1

牛磺酸上调基因1(Taurine-Up-Regulated Gene 1,TUG1)是一种长度为7.1 kb 的lncRNA,在PASMC的细胞质和细胞核中都有表达,其在哺乳动物中高度保守。既往的研究表明TUG1参与调控蛋白和miRNA的表达,在细胞增殖、凋亡和染色质的调控重塑中起重要作用。Yang等的研究表明,TUG1在缺氧诱导的小鼠模型和PASMCs中高表达。TUG1通过与miR-374c结合,上调Foxc1的表达,而沉默的TUG1通过结合miR-374c下调Foxc1表达,从而抑制增殖和迁移,并通过Notch信号通路促进PASMCs凋亡,阻碍PAH的肺血管重构[10]。Wang[11]等的研究发现TUG1是通过结合miR-328来调节HPASMCs的增殖和细胞周期,而TUG1是否还通过其他机制调节PAH,如表型转换,免疫失调,炎症反应等,仍需要进一步研究。

4 MALAT1

转移相关肺腺癌转录物1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1,MALAT1)是一种高度保守的lncRNA,已发现其参与多种癌症发病机制,Brock等报道了MALAT1在低氧的HPASMCs和缺氧诱导的小鼠肺组织中显著升高,并发现MALAT1可促进PASMCs的增殖和迁移,并调节它的表型。此外,MALAT1基因敲除可以抑制体外PASMC的增殖,通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达来抑制小鼠模型心肌肥厚[12]。而Zhuo等,在MALAT1基因上识别了一个与PAH易感性相关的单核苷酸多态性序列rs619586A>G,而MALAT1 rs619586 GG等位基因对PAH有保护作用。进一步的功能实验表明,MALAT1中rs619586A到G的改变可以通过作为miR-214的竞争性内源性RNA (ceRNA)直接上调X盒结合蛋白1 (XBP1)的表达,并因此通过缩短S-M相变来抑制血管内皮细胞的增殖和迁移[13]。此外,还有研究表明MALAT1通过调节miR-503/Toll样受体4促进HPASMCs迁移和增殖[14]。这表明MALAT1可能通过多种路径抑制PASMC的增殖。

5 MEG3

母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)位于人类染色体14q32上,长度为1.6kb,它是一种肿瘤抑制因子。Piccoli等的研究表明,MEG3主要定位于缺氧PASMCs的细胞质中,在缺氧诱导的PAH动物模型和特发性肺动脉高压患者的PASMCs中表达水平显著升高[15]。MEG3通过肺特异性传递小干扰RNA (siRNA)进行敲除后,可抑制PAH在体内的发展。MEG3基因沉默后,特发性肺动脉高压(idiopathic pulmonary hypertension,IPAH)患者的PASMCs和体外缺氧暴露的PASMCs二者的细胞增殖和细胞周期进程均减弱,此外MEG3还可与microRNA-328-3p (miR-328-3p)相互作用并导致其降解,导致胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)上调。这可能揭示了MEG3在缺氧诱导PASMC增殖中存在多种调控机制[16]。

6 ANRIL

INK4位点上的lncRNA反义非编码RNA (Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus,ANRIL)是一段长126kb的长链非编码RNA,包含19个外显子,定位于染色体9p21区域的INK4位点上。ANRIL首先在家族性黑色素瘤患者中发现。ANRIL的失调和血管内皮功能障碍、细胞增殖、凋亡、迁移、血管平滑肌细胞的衰老、单个核细胞增殖和粘附以及DNA损伤有关。Wang等人的研究表明,ANRIL在缺氧的HPASMCs中表达显著下降,而siRNA导致的ANRIL静默加速了细胞周期进程,使更多的HPASMC从G0/G1期进入G2/M+S期,增加了缺氧暴露的HPASMCs细胞增殖和迁移,证明ANRIL在缺氧HPASMCs中起重要作用[17],这可能为PAH的治疗提供了新的靶点,但仍需要更多的研究去证实及探索更多的作用机制。

7 TYKRIL

生物信息学分析发现酪氨酸激酶受体诱导lncRNA(Tyrosine Kinase Receptor Inducing LncRNA,TYKRIL)是所有条件下唯一普遍上调的lncRNA。PDGF、IL-18 和TGF-β等促PAH因子可诱导TYKRIL表达上调。有研究表明TYKRIL可通过p53/PDGF信号轴促进PASMC细胞增殖,同时抑制其凋亡。且在体外对IPAH患者的肺精确切割薄片(PCLS)研究,证明用GapmeR介导的PCLS中TYKRIL的敲除,可逆转肺血管重构,说明TYRIL对PAH有潜在的治疗作用[18]。

8 SMILR

平滑肌富集lncRNA(Smooth Muscle Enriched Long Noncoding RNA,SMILR)的表达已被证明在PAH患者、MCT诱导的PAH模型和缺氧诱导的HPASMCs中高表达。一项体外研究表明,SMILR的下调通过靶向miR-141抑制缺氧诱导的PASMC的增殖和迁移,SMILR 的双链RNA在MCT诱导的PAH大鼠模型中的传递,可通过靶向Rho/ROCK/miR-141轴改善PAH和肺血管重塑[19]。但其目前在PAH中的研究仍非常有限,未来需要更多的研究去证实及探索其在PAH中的作用。

9 PAXIP1-AS1

一项小样本的研究发现PAXIP1-AS1在IPAH患者的肺小动脉,血管外膜成纤维细胞和PASMC中表达上调。而PAXIP1-AS1的抑制可通过靶向其下游的桩蛋白促进细胞凋亡,抑制PASMC的增殖和迁移[20]。还有研究亦得出PAXIP1-AS1的表达在缺氧诱导的大鼠PAH模型和缺氧的PASMCs中均显著升高。该研究发现PAXIP1-AS1通过与WIPF1/RhoA复合体相互作用,招募转录因子ETS1形成调控复合体充当支架的作用。PAXIP1-AS1的敲除显著抑制缺氧诱导的HPASMCs的细胞活力和迁移[21]。

10 RPS4l

核糖体蛋白S4l(Ribosomal Protein S4-Like,RPS4l)是Liu等在缺氧诱导的小鼠PAH模型中,通过高通量RNA测序技术发现了其在肺组织中的表达降低,并在PASMCs中也验证了这一点。RPS4l可通过调控PASMCs中白细胞介素增强剂结合因子3 (ILF3)和缺氧诱导因子1 (HIF-1α),来调节细胞增殖、迁移和细胞周期进程等功能,而转基因小鼠过表达RPS4l可通过减少肺血管重构和右心室肥厚来减缓PAH的发展[22]。进一步的研究发现,RPS4l编码的一条新肽RPS4XL,在缺氧诱导的PAH和缺氧PASMCs中下调。RPS4XL通过抑制其结合蛋白RPS6的磷酸化来抑制缺氧诱导的PASMC的增殖,表明这条肽可能在缺氧的PAH中起作用[23]。但这些仍需要更多的研究在体内及PAH患者中证实。

11 GAS5

LncRNA生长停滞特异性转录本5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)已被发现在多种肿瘤中表达下调,比如肺、乳腺、膀胱、胃、前列腺和胰腺癌等,表明GAS5可能在细胞生长和增殖中起抑制作用。近来,在缺氧诱导的PAH大鼠的肺和缺氧的PASMCs中,GAS5的表达被发现显著下调,用siRNA沉默GAS5的表达可能通过GAS5/miR-23b-3p/KCNK3信号轴来刺激HPASMCs的迁移和增殖[24]。与此一致的是用血小板源生长因子BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)处理的PASMC中也发现了GAS5表达的下调,进一步的研究发现GAS5通过靶向miR-382-3p调节慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)大鼠的肺动脉壁增厚、血管生成和自噬[25]。Wu等在CETPH患者及大鼠模型中采集肺动脉内皮细胞,研究亚精胺(SP)诱导自噬的机制中发现,SP诱导的自噬使PAECs中的GAS5升高。GAS5的下调则可逆转了SP在PAECs中的作用,进一步的研究发现GAS5在体内外通过miRNA 31 5p/NAT8L信号通路促进SP诱导的自噬,表明GAS5未来可能是治疗CTEPH分子标记物之一[26],但是目前GAS5与其他的lncRNA存在一样的问题,其多在啮齿动物模型中研究,在哺乳动物中或是体内研究甚少,未来还有很大的研究潜力

12 PAHRF

肺动脉高压相关因子(Pulmonary Arterial Hypertension Related Factor,PAHRF),又名NONHSAT169231.1,位于人类14号染色体上,缺氧暴露的HPASMCs和PAH患者的肺动脉中有较低的PAHRF表达水平,PAHRF过表达抑制HPASMCs的细胞增殖,促进细胞凋亡,然而对它进行敲除则得到相反的效果。PAHRF可以通过内源性吸附miR-23a-3p,最终使MST1的表达下调。过表达PAHRF的质粒在缺氧条件下可抑制miR-23a-3p的表达,从而刺激HPASMCs增殖和抑制凋亡来促进缺氧肺动脉高压的肺血管重塑[27]。

13 MANTIS

又称n342419,有研究表明其在MCT- PAH大鼠模型和晚期IPAH患者的肺中表达降低,在人胶质母细胞瘤患者分离出的ECs中和喂养动脉粥样硬化饮食的食蟹猴颈动脉中明显升高。表明MANTIS在不同疾病中表达具有特异性,进一步的研究表明,如果对 MANTIS进行抑制或敲除,在注射了基质嵌入的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)小鼠体外实验中,ECs的迁移,血管管腔形成和血管出芽均受到抑制,这可能解释了由于MANTIS下调导致PAH患者远端肺动脉血管生成受阻的原因[28]。

二、LncRNA在PAH中的诊断作用

目前已经发现多种lncRNA在PAH中表达异常,参与了PAH的不同阶段。Omura等的研究发现血浆H19水平可以区分PAH患者与对照组,其水平与RV功能相关,并还能预测长期生存,这表明H19可能是PAH诊断和预后生物标志物,且已有指南将其纳入PAH预后分层的亚组[29]。还有小样本的研究中发现IPAH患者肺小动脉,血管外膜成纤维细胞和PASMC中PAXIP1-AS1的增高[20],除此之外还有研究发现PAH患者血浆中MALAT1增高[14],这些都可能成为PAH诊断的生物标志物。但目前仍缺乏在人类大样本中的研究,且各种lncRNA参与的PAH发生发展的阶段仍不明,导致在患者中采集标本的时机不明,可能影响其作为生物学标记物的开发。其在临床实践中实现更准确的PAH风险分层、诊断和预后管理仍有很大的潜力。

三、LncRNA在PAH中的治疗作用

目前,针对lncRNA的作用仅在一些肿瘤的动物模型中进行,且因为lncRNA在物种间的保守性很差,目前尚无理想的人类PAH模型,这使得开发和测试用于人类的lncRNA药品非常困难。此外,多数lncRNA存在于细胞核,且具有高度二级结构,这使得 siRNA与这部分lncRNA结合并使其沉默变的困难,而构建lncRNA高表达质粒的方式也存在受限于细胞核的问题,Yin等[30]设计了 Sno载体,其可以稳定地表达任何感兴趣的序列,并限制其在细胞核中的积累,并且可能保持着正常的核关联核功能,这可能为这些定位在细胞核的lncRNA功能的探索提供新的方法。

四、结语

PAH是一种以肺血管重构为特征的疾病,可导致肺动脉压持续升高、右心衰甚至死亡。lncRNA是转录和转录后水平调控基因表达的关键分子。目前大量的证据表明lncRNA是PAH发病和进展的重要作用。新的PAH相关lncRNA及其调控机制不断发现。这些lncRNA不仅有望成为治疗药物的有效靶点,还可能为PAH分层、预后方面提供依据。但是,目前的研究多在体外或啮齿动物模型中进行,其主要的建模方法为缺氧和野百合碱诱导模型,而建立灵长动物模型可行栓塞或动静脉分流术,但 PAH形成的机制复杂,目前鲜有研究对这些动物模型和人类PAH的相关性进行研究,而有关lncRNA治疗研究也非常有限,尤其在临床应用方面。因此,需要继续研究lncRNA的作用机制,探索更有效的、可及的靶点;同时探索建立理想的PAH模型,使lncRNA相关的药物能够走向临床应用。