乔阳至子,杨道文

(1.北京中医药大学,北京 100029;2.中日友好医院,北京 100029)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma,CVA)是哮喘特殊的类型,以慢性咳嗽为主要或唯一临床表现,气道炎症反复发生导致的平滑肌细胞肥大、气道重塑是本病的主要病理生理过程。西医对本病的治疗方式以支气管扩张药物、激素吸入剂、白三烯受体拮抗剂等为主[1],部分患者经西医规范治疗后无明显症状改善,甚至进一步发展为典型哮喘。中医治疗本病疗效显著,经验丰富,且具有副作用少、复发率低的特点。吾师杨道文教授从事中医学临床、教学工作多年,专注于论治肺系及脾胃病,对慢性咳嗽、CVA的治疗尤为擅长,总结出治疗CVA的专方——益气疏风降肺方。本方重用黄芪、炒白术,补益肺脾之气,又补中兼行,使气充而不滞,加炙麻黄、杏仁、枇杷叶、百部,宣肺止咳,切中咳嗽之临床表现,益以醋柴胡、酒白芍、酒黄芩,入肝经以疏肝气、敛肝气,肝气调畅则内风可止,又用僵蚕、蝉蜕、蜂房虫类药,入络搜风、息内风解痉止咳,风不摇则钟鸣自止,本方还化裁了旋覆代赭汤,取旋覆花、代赭石降逆和胃,尤宜久咳而兼见胃虚呕逆之人,又加厚朴,增强降胃气之力,桔梗、枳壳二者一升一降,能调畅胸中滞气。诸药合用,共奏益气疏风、肺胃同降之功,是肺胃同治理论的具体体现,在前期临床试验中,本方已被证实收效满意[2],单用本方的治疗组有效率为94.45%,对照常规西药治疗总有效率为77.78%,不良反应发生在治疗过程中出现次数亦较传统西医治疗少。临床研究疗程结束后,课题组对达到临床痊愈的参与者进行了为期6个月的随访,发现治疗组的远期复发率为10%,显著低于对照组的56.3%。

临床观察已证实益气疏风降肺方可以有效改善CVA症状,但其可能的靶点及作用机制还未得到阐明,需要进一步研究探讨。网络药理学是通过利用药物间存在的功效、结构等相似性,结合机体内生物效应分子、靶标分子的作用关系,利用与疾病相关的基因进行联合分析,从而构建药物-成分-靶点-疾病的调控网络的一种研究方法,是探索中药复方活性成分、作用机制和潜在靶点的有效手段;分子对接是利用受体所具有的特征以及药物分子与受体作用方式来开展药物研究的一种方法,重点是对分子间相互作用开展研究分析,并对其中存在的亲和力以及结合模式加以预测,进而寻找药物可能发挥作用的活性分子和潜在作用靶点。本研究拟采取网络药理学分析建立益气疏风降肺方各活性成分间的互作网络,寻找共同靶点,应用分子对接技术考察药物主要活性成分与疾病靶点之间的结合强度,以期初步揭示益气疏风降肺方治疗CVA的潜在分子机制,为CVA中药复方的临床应用提供一定的理论依据。

1 方法

1.1 益气疏风降肺方活性成分的筛选和靶点预测

本研究首先从中药系统药理学数据库和分析平台(TCM-SP,https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索出益气疏风降肺方中16味中药的活性成分,以分子的类药性(drug like,DL) ≥0.18、口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%为筛选标准对其筛选。其中代赭石根据文献查阅结果其化学成分主要为三氧化二铁,以此录入TCMSP中筛选。僵蚕和蜂房使用TCMSP无法查询到活性成分,通过查询HERB数据库(http://herb.ac.cn/Search/)获取其活性成分。将检索得到的益气疏风降肺方中16味药物的活性成分输入SwissTarget Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)从而对其潜在靶点加以预测,将预测得到的结果通过Cytoscape 3.7.1软件进行“药物活性成分-靶点”网络图的构建。

1.2 CVA相关靶点检索

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)和PharmGkb数据库中,以“cough variant asthma”为关键词进行检索,将各数据库所获得的靶点汇总并删除重复值,获取CVA治疗相关基因。

1.3 益气疏风降肺方治疗CVA核心靶点蛋白质互作网络图构建

使用R软件对药物潜在靶点和疾病靶点基因绘制韦恩图,获取共同靶点为益气疏风降肺方的候选治疗靶点。利用STRING(https://string-db.org)网站对候选治疗靶点进行PPI网络构建,建立靶蛋白之间的网络关系。通过cytoscape 3.7.1的cytoHubba插件分析PPI结果,计算每个基因的degree、betweenness、Eigenvector、LAC、Network和closeness六个参数,筛选出相应的关键治疗靶点来开展后续的分析。

1.4 基因本体(gene ontology,GO)及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析

在GO和 KEGG的富集分析方面本研究采用R软件对其开展分析(使用R软件的“colorspace”包、“stringi”包、“ggplot2”包和bioconductor中的“DOSE”包、“clusterProfiler”包、“enrichplot”包和“pathview”包进行信号通路富集分析;使用R软件的“colorspace”包、“stringi”包、“ggplot2”包和bioconductor中的“DOSE”包、“clusterProfiler”包和“enrichplot”包进行GO富集分析),设PValue Cutoff为 0.01,获取前10项具有显著性差异的GO和KEGG,绘制条形图进行可视化分析,探讨益气疏风降肺方治疗CVA可能的生物过程和信号通路。

1.5 分子对接

从Pub-chem数据库和PDB数据库(http://www.Rcsb.org/)下载前述步骤筛选得到的疾病核心靶点蛋白质的结构和及药物活性成分3D结构,利用AutodockTools、PyMOL1.8软件处理后以“pdbqt”格式的文件加以保存,然后则通过Autodock-vina软件来开展相应的分子对接,利用分子与靶点的最低结合能做出热图,最后通过PyMol软件构建对接相互作用模式图,使得对接结果可视化。

2 结果

2.1 益气疏风降肺方活性成分及靶点获取

以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件,从TCMSP数据库检索相应的化合物,获取黄芪、白术、麻黄、苦杏仁、枇杷叶、百部、蝉蜕、旋覆花、厚朴、枳壳、桔梗的活性成分和对应靶点,通过检索HERB数据库以相同条件获取僵蚕和蜂房的活性成分,再利用SwissTargetPrediction数据库筛选出僵蚕和蜂房有效成分所对应的疾病靶点,其中赭石是矿物质成分三氧化二铁(Fe2O3),在现有数据库未找到其对应的有效成分和对应靶点,故暂未进行相关研究。筛选去除重复的潜在靶点后得到益气疏风降肺方活性成分共200个,潜在作用靶点619个(表1),对益气疏风降肺方中所有药物的活性成分进行排序,其中口服利用度较好的前十位见表2。

表1 益气疏风降肺方中各药物对应活性分子数量及对应靶点统计

表2 益气疏风降肺方OB值较高的部分活性成分

2.2 疾病靶点和候选治疗靶点的筛选

通过在GeneCards数据库、 DrugBank数据库、OMIM数据库、PharmGkb数据库以“cough variant athsma”为关键词进行搜索,收集CVA相关疾病基因。经统计,GeneCards数据库中共有2144个疾病靶点,DrugBank数据库共有8个疾病靶点,OMIM数据库共有104个疾病靶点,PharmGKb数据库中共有101个疾病靶点,共得到疾病靶点个2357,使用R语言进行venn图的绘制(如图1)并去除重复靶点,得到疾病靶点2236个。将2236个疾病靶点与2.1中得到的药物潜在靶点取交集,得到331个候选治疗靶点,交集情况如图2所示。

图1 CVA治疗靶点韦恩图

图2 益气疏风降肺方-CVA靶点韦恩图

2.3 构建中药-有效成分-靶点网络

利用Cytoscape 3.7.1绘制益气疏风降肺方的作用靶点和活性成分的关系网络(图3),其中Degree值以节点面积大小表示,面积越大,则表示对应着越多的生物功能,活性物质与作用靶点之间的关系以连线表示,发出的连线越多表明该活性物质可能干预的靶点越多。由图3可知益气疏风降肺方中作用靶点数量排名前6的活性物质为槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素、山柰酚、咖啡酸、棕榈酸,推测为治疗CVA较为有效的活性成分。考虑益气疏风降肺方候选的有效治疗靶点较多,将Degree值从高到低排序,取Degree值≥10的靶点进行展示(表3)。

注:左侧圆环为活性成分,右侧为作用靶点,连线表示活性成分与作用靶点之间存在相互关系;红色:百部,蓝色:白术,黄色:蝉蜕,紫色:蜂房,绿色:厚朴,粉色:黄芪,褐色:僵蚕,浅蓝色:桔梗,深蓝色:苦杏仁,白色:麻黄、灰色:枇杷叶,浅绿色:旋覆花,浅粉色:枳壳

表3 益气疏风降肺方作用靶点(Degree值≥10)

2.4 益气疏风降肺方治疗CVA的核心靶点PPI图

通过SRTING平台获得共同靶点PPI网络图(图4),置信度为0.98(Confidence = 0.98),去除离散的蛋白,得到205个节点和978条边的互作网络(节点代表蛋白,边代表互相作用关系)。

图4 益气疏风降肺方-CVA共同作用靶点的PPI网络

2.5 筛选关键治疗靶点

将上一步得到的205个蛋白输入cytoscape 3.7.1,利用cytoHubba 插件计算每个基因的degree, betweenness, Eigenvector,LAC, Network和closeness六个参数,对这六个参数以中位值进行筛选。首先以degree>6、betweenness>20.418、Eigenvector>0.013、LAC>1、Network>1.143和 closeness>0.03进行第一次筛选,由205个蛋白筛选至54个。筛选网络图如图5A所示,黄色节点是筛选到的蛋白。接下来以degree>7、betweenness>21.431、Eigenvector>0.085、 LAC>3、Network>4和closeness>0.463进行第二次筛选,由54个蛋白筛选得到18个核心靶点(图5B),其中黄色节点则是筛选到的核心基因(图5C)。核心靶点的信息见表4。其中,转录信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是介导炎症反应的关键分子,属于蛋白酪氨酸激酶(janus kinase,JAK)/STAT3 信号 通路,此通路是细胞固有免疫应答炎症细胞因子信号转导通路之一,可被多种因素激活进而编码一系列炎症相关蛋白,参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等病理生理过程[3-4],与CVA的发生发展中具有强相关性。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protien kinase,MAPK)1/3则是细胞外调节蛋白/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路的下游因子,此通路可将细胞外信号转导入胞内,在炎症反应中发挥重要作用,可以调节炎性因子的产生、调控炎细胞的增殖分化和凋亡,慢性气道疾病的炎症机制中重要的一环[5]。肿瘤蛋白(tumor protein, TP) 53已被证实与迟发性哮喘的易感性有关[6]。

A．第一次筛选得到的网络;B.第二次筛选得到的网络;C.核心基因

表4 核心靶点基本信息

2.6 GO和KEGG通路富集分析生物过程、细胞组分及分子功能

本研究共富集到182条KEGG信号通路,3316个GO细胞生物学过程。把KEGG 结果的前30条通路用气泡图展示(图6),富集名称位于左侧,气泡红色越深表示qvalue越大,气泡越大 表示富集于该通路的基因越多,由图可知益气疏风降肺方的活性分子富集于磷脂酰肌醇3激酶/ 蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、MAPK、 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor,TNF)、辅助性T细胞(T helper cell,Th)17分化等通路, GO富集结 果分别取生物学过程(biological process, BP)、细胞组分(cell components,CC)、分子 功能(molecular function,MF)的前10条目用条形图展示(图7),可知益气疏风降肺方的 治疗作用与细胞氧化应激、铁死亡、炎症反应过程、细胞凋亡与增殖等生物学过程有关,提示益气疏风降肺方可能通过多个信号通路发挥治疗CVA的作用。

图6 KEGG信号通路富集分析

图7 GO基因功能富集分析

2.7 分子对接验证

选取Degree值靠前且与CVA关系较密切的基因TP53、MAPK1、MAPK3、TNF、EGFR、STAT3与益气疏风降肺方的主要活性物质(槲皮素、EGCG、木犀草素、山柰酚、咖啡酸、棕榈酸)进行分子对接,潜在结合能均≤-5 kcal/mol,可初步推断益气疏风降肺方的主要活性物质与CVA潜在治疗靶点具有较好的结合活性,具体对接的最低结合能详见表4。其中EGCG与关键靶点结合活性好,对接的分子能最低,其分子对接模式图见图8。

A.MAPK1和EGCG结构分子对接结果(最低结合能-9.4 kcal/mol);B.MAPK3和EGCG结构分子对接结果(最低结合能-9.4 kcal/mol);C.TP53和EGCG结构分子对接结果(最低结合能-9.2 kcal/mol)

表5 主要活性物质分子与关键靶点对接最低结合能(kcal/mol)

3 讨论

本研究对益气疏风降肺方的有效成分和潜在作用靶点进行了筛选和分析,通过观察益气疏风降肺方的作用靶点和活性成分的关系网络,可以发现益气疏风降肺方的不同药味中可能有着一样的活性成分,不同成分也有可能会和同一靶点产生关系,充分体现了中药复方制剂组分丰富、靶点众多、通路复杂的机制特点。

通过对益气疏风降肺方组成药物的活性成分进行研究和文献学习,发现Degree值较高的活性成分中,槲皮素一方面可以抑制中性粒细胞白介素(interleukin,IL)-6的表达水平,从而在炎症早期即发挥明确的抗炎作用[7],一方面还可以调节核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)功能,在蛋白水平和mRNA水平对环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶、C反应蛋白表达加以抑制[8],调控机体的炎症反应。作为一种蛋白激酶抑制剂,槲皮素还能竞争性结合磷脂酰肌醇3激酶等腺嘌呤核苷三磷酸结合位点,使得激酶磷酸化状态得到改变,从而让其失去活性。另外,槲皮素也能够对蛋白激酶C的活性加以抑制,阻断Ca2+内流进入细胞,使得炎症介质如白三烯、组胺的释放受到抑制,减轻炎症反应的发生。槲皮素还可以通过对辅助型T细胞1/辅助型T细胞2稳定性调节、减少B细胞释放抗原特异性免疫球蛋白E抗体等方式在抗炎和机体的免疫功能调节中发挥重要作用[9]。EGCG是一种绿茶多酚类分子,具有抗氧化、清除自由基、抗癌、增强免疫功能等方面具有生物学活性,研究证实EGCG可以抑制巨噬细胞凋亡,减轻免疫细胞炎症反应[10]。在对哮喘模型小鼠的研究中发现ECGC能够组织炎细胞向肺组织中募集,降低小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的表达,抑制黏液分泌、减少杯状细胞化生等,从抑制炎症过程、减轻气道重塑等多个方面气道减轻模型动物卵清蛋白诱导下的哮喘发生[11]。山柰酚能够对酪蛋白激酶2活化加以抑制,阻断支气管上皮内质网应激,从而减少呼吸道黏液分泌。山柰酚还能够对支气管上皮细胞蛋白酶激活受体的功能加以调节,抑制支气管上皮细胞转化为间质细胞,从而使得纤维化气道重塑减轻[12-13]。CVA发病与病毒感染、免疫功能调节等有关[14],其发生过程中伴随着炎症因子的显著升高,从而引起气道慢性炎症、高反应性、气道重塑等病理过程[15],通过对主要活性成分的药理作用进行研究,可知益气疏风降肺方可以通过减少炎症因子的释放、减轻炎细胞募集过程、抑制气道黏液分泌、阻止气道重塑等方式降低气道高反应性、减少气道炎症反应、对气道重塑加以抑制,从而实现相应的治疗作用,与CVA发病机制相符。

从核心靶点和益气疏风降肺方主要活性成分对接结果分析,推测本方活性成分可能通过调控细胞增殖与凋亡过程、胞外信号转导、免疫细胞分化、炎症因子释放等过程抑制细胞炎症、调节免疫反应、抑制气道重塑发生。其中STAT3是一种多功能的转录因子,和JAK/STAT信号通路有关,作为本方Degree值最高的潜在靶点在许多细胞过程中起关键作用。根据动物实验的结果,IL-6结合了细胞上的特异受体后,通过JAK/STAT3信号转导途径实现STAT3的活化,进而引起T细胞炎症通路得到激活,STAT3诱导还能使巨噬细胞产生抗炎症因子IL-10,从而调节机体免疫反应[16]。KEGG通路富集发现本方治疗CVA的关键通路包括PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Th17细胞分化、IL-17信号通路等。PI3K-AKT信号通路在调节细胞存活、增殖和凋亡过程中占有重要地位,此通路可以通过多种途径调节细胞周期,与细胞的生长、存活和凋亡密切相关,是目前抑制CVA患者气道重塑的研究热点[17-19]。TNF信号通路不仅参与细胞周期调控,还与炎症反应和免疫反应关系密切,此通路激活后可促使NF-κB入核,引起多种炎症因子和趋化因子的过度表达,导致炎症和免疫反应加重[20]。在变态反应炎症的抗原致敏方面,Th-17阳性T细胞及IL-17发挥着重要作用[21]。

综上,本文通过网络药理学和分子对接技术,发现益气疏风降肺方通过多通路、多靶点、多成分治疗CVA,分析了其相互作用关系,证实了益气疏风降肺方活性物质与CVA的核心治疗靶点具有较强的结合力,其主要活性成分槲皮素、山柰酚、EGCG、木犀草素等可通过调节STAT3、MAPK、ESR1、ATK1、TP53等关键靶点,干预PI3K/AKT信号通路、Th17细胞分化、IL-17炎症细胞因子通路等关键生物过程,从而实现对机体的免疫反应及细胞的增殖、分化、凋亡等产生影响,调节细胞炎症反应发生发展,使得慢性炎症得到改善,并对气道重塑加以抑制,以此来实现CVA治疗效果。结合上面的分析成果,下一步可围绕益气疏风降肺方对于PI3K/AKT、MAPK、IL-17等信号通路的作用及本方对气道上皮细胞凋亡的具体影响等展开进一步研究。本研究也能够指导益气疏风降肺方的临床应用,在治疗CVA新药物的研制方面提供一定的线索。但本研究的结果和结论受数据库信息不全、疾病靶点未得到彻底研究等问题的限制,筛选和预测的结果均存在一定的偏倚,仍需要通过进一步的临床和实验研究加以验证。