杨晓春，黎重阳，张玲玲，王荣春，张英春, ，卢卫红,

（1.哈尔滨工业大学医学与健康学院，黑龙江哈尔滨 150001；2.哈尔滨工业大学重庆研究院，特色药食资源开发智能化装备研究中心，重庆 401135；3.四川工大西南食品研究有限责任公司，四川巴中 636063）

睡眠是一种较为复杂的生理过程。睡眠功能障碍已成为当前常见疾病，该疾病的发生与精神、生理疾病等密切相关，严重损害人们的健康，并影响正常的工作和生活[1]。根据2020 年中国睡眠研究会公布的调查结果显示，我国约有38.2%的人口存在失眠障碍问题，人均每日睡眠时间不足7 h。近年来，中国人整体入睡时间延迟了2～3 h，且失眠逐渐呈年轻化趋势。目前，睡眠功能障碍主要依赖于镇静催眠类药物进行治疗，但存在一定的成瘾性和毒副作用，长时间服用容易使人产生胃肠道不适、乏力以及记忆力减退等症状。近年来，消费者开始逐渐意识到植物药和植物提取物对健康的益处，对保健品的接受度也越来越高。因此，天然植物成分在睡眠健康中的应用需求显著增加。

芦笋（Asparagus officinalisL.）又名石刁柏，为天门冬科天门冬属多年生草本植物[2−3]。芦笋是一种营养价值和保健价值较高的名贵蔬菜，被列为“世界十大蔬菜之首”，国际上素有“蔬菜之王”的美称[4−6]。芦笋营养价值很高[7]，除富含多种维生素和微量元素等成分外[8]，同时含有芦笋皂苷[9−10]、黄酮[11−12]、多糖[13−14]等多种具有药用价值的活性成分。其中，芦笋皂苷因具有较好的调节免疫[15−16]、抗肿瘤[17−18]、降血糖[19]等功效，逐渐受到国内外专家学者的关注。近年来，皂苷类成分，如酸枣仁皂苷，因在治疗神经衰弱、改善睡眠等症方面具有良好的调节作用，逐渐成为治疗失眠方面的研究热点[20−22]。目前，对于芦笋皂苷在改善睡眠功能方面的研究还鲜有报道。四川省巴中市恩阳区种植绿芦笋的历史悠久，恩阳芦笋已荣获国家农产品地理标志认证，恩阳区也被授予“中国芦笋之乡”的称号。在前期研究中发现，恩阳芦笋中芦笋皂苷含量较为丰富，精深加工潜力较大。本实验以恩阳绿芦笋为主要原料，采用响应面法优化速溶粉的酶解工艺条件，同时利用动物实验考察其改善睡眠功能的效果，旨在为新型芦笋助睡眠类保健食品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

恩阳绿芦笋 巴中市惠丰农业开发有限公司；果胶酶（10 万U/g）、纤维素（10 万U/g）夏盛实业集团有限公司；健康昆明种小鼠 体重20±2 g，单一雄性，哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心（许可证号：SCXK（黑）2019-001）；菝葜皂苷元 ≥98%纯度，上海倍卓生物科技有限公司；冰醋酸 ≥99%纯度，北京市通广精细化工公司；酸枣仁皂苷 ≥98%纯度，南京泽朗医药科技有限公司；巴比妥钠（≥95%纯度）、戊巴比妥钠（≥99%纯度）Sigma-Aldrich 公司。

YB5001B 电子太平 上海衡际科学仪器有限公司；ES220 精密天子天平 天津市德安特传感技术有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅 常州鸿泽实验技术有限公司；RE-520 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；D-3L 纳米高压均质机 美国phD 科技（国际）有限公司；ADL311-A 台式喷雾干燥机 日本Yamato 大和科学株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 速溶芦笋粉的加工工艺 速溶芦笋粉的加工工艺流程如下：

1.2.1.1 操作要点 a.前处理：准备好新鲜绿芦笋，流动水清洗去除表面泥沙，再去除芦笋根部一端的老皮，控干水分备用；b.烫漂：烫漂水预先加热至85～90 ℃左右，添加0.03%～0.05%的柠檬酸进行护色。烫漂时笋尖向上，基部先烫漂2～3 min，然后整条再烫漂1～2 min，迅速捞出后冷却至36 ℃以下，控干水分备用[23−24]；c.酶解：添加一定量纤维素酶和果胶酶（质量比为1:1），在适宜的温度和pH 下对打浆后的芦笋浆进行一定时间的酶解处理[25−26]；d.离心：酶解液经过滤后在4000 r/min 下离心10 min 处理[27]；e.均质：均质温度控制在50～60 ℃，均质压力控制在25～30 MPa；f.浓缩：将芦笋浆旋转蒸发至固形物含量20%以上；g.喷雾干燥：加入麦芽糊精，将芦笋浓缩液预热至55 ℃以上后再进行喷雾干燥，进料流量900 mL/h，进风温度180 ℃，出风温度100 ℃；h.冷却、包装和检测：待产品冷却后，在无菌条件下装入预先准备好的包装袋内，密封后进行检测。

1.2.1.2 酶解工艺条件的单因素实验 a.复合酶添加量对出粉率和芦笋皂苷含量的影响：在酶解温度65 ℃，酶解时间2.0 h，pH4.8 的条件下，探究复合酶添加量（果胶酶和纤维素酶按质量比1:1 复配）分别为0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%和0.14%时，对出粉率和芦笋皂苷含量的影响；b.酶解温度对出粉率和芦笋皂苷含量的影响：在复合酶添加量选择a 得出的最优结果，酶解时间2.0 h，pH4.8 的条件下，探究酶解温度分别为55、60、65、70、75 和80 ℃时，对出粉率和芦笋皂苷含量的影响；c.酶解时间对出粉率和芦笋皂苷含量的影响：在复合酶添加量、酶解温度分别选择a、b 得出的最优结果，pH4.8 的条件下，探究酶解时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 h 时，对出粉率和芦笋皂苷含量的影响；d.pH 对出粉率和芦笋皂苷含量的影响：在复合酶添加量、酶解温度、酶解时间分别选择a、b、c 得出的最优结果的条件下，探究pH 分别为3.6、4.0、4.4、4.8、5.2 和5.6 时，对出粉率和芦笋皂苷含量的影响。

1.2.1.3 酶解工艺条件的响应面试验 根据1.2.1.2的单因素实验结果，分别选取复合酶添加量、酶解时间、酶解温度和pH 作为Box-Behnken 试验设计的关键因素，速溶芦笋粉出粉率和芦笋皂苷含量为响应值，采用Design Exper.V 8.0.6.1 软件进行Box-Behnken试验设计。试验因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验设计表Table 1 Experimental design of RSM

1.2.2 指标检测

1.2.2.1 速溶芦笋粉的出粉率测定 在喷雾干燥、冷却至常温后，取样测定速溶芦笋粉的出粉率。速溶芦笋粉的出粉率用以下公式计算：

式中：A 为喷雾干燥后最终获得的速溶芦笋粉总质量，g；B 为芦笋原料质量，g。

1.2.2.2 速溶芦笋粉中总皂苷的测定方法 参照葛思琪等、才卫川等[28−29]的实验方法，并加以改进。精密称取20.0 mg 菝葜皂苷元，加甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，得2 mg/mL 溶液。再分别稀释成梯度为0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL 的菝葜皂苷元标准溶液，备用。分别移取上述不同浓度的菝葜皂苷元标溶液100 μL，置于20 mL 的具塞量筒中，于70 ℃水浴将溶剂挥发至干。依次加入0.2 mL 5%香草醛乙酸溶液，0.8 mL 高氯酸溶液（70%），振动混匀，加塞于70 ℃水浴中静置15 min，取出后再冰浴5 min，冷却至室温。最后加入冰醋酸（≥99%）5 mL，振荡混匀即可。以甲醇为空白，按照上述操作方法制备参比溶液，于535 nm 波长下测定吸光度值，最终以吸光度为纵坐标，不同浓度（mg/mL）的菝葜皂苷元为横坐标，绘制标准曲线，经回归分析，得回归方程为y=1.1928x−0.0135，R2=0.9987。表明菝葜皂苷元标准曲线在0.2～1.0 mg/mL 范围内与吸光度呈现良好的线性关系，可作为芦笋总皂苷含量测定的标准曲线。

精密称取实验制备的速溶芦笋粉样品10.0 g，用25 mL 蒸馏水溶解于500 mL 三角瓶中。按测定标准曲线的方法测定速溶芦笋粉的吸光值，以不加速溶芦笋粉为空白对照，计算速溶芦笋粉中的芦笋总皂苷含量。芦笋皂苷含量用以下公式计算：

式中：X 为芦笋总皂苷含量，%；A 为样品显色后吸光值；a 为回归直线斜率；b 为回归直线截距；m 为样品质量，g；V1为样品溶解定容体积，mL；V2为样品加样体积，mL。

1.2.3 速溶芦笋粉干预小鼠睡眠功能实验 参照马淑凤等、黄云祥等[30−31]实验方法，并加以改进。饲养环境，23±2 ℃，湿度55%±10%，12 h 光照，12 h 黑暗，自由供给食物和水。适应性喂养7 d 后，随机分为5 组，每组10 只，即空白对照组（NC）、阳性对照组（酸枣仁皂苷360 mg·kg−1，以粗品的浓度计）、速溶芦笋粉低、中、高剂量组分别设置为50、100 和200 mg·kg−1（速溶芦笋粉推荐剂量为成人（按60 kg 体质量计）每日人 300 mg，相当于 5 mg 每日kg 体质量。速溶芦笋粉低、中、高剂量组分别设人体推荐量的10、20、40 倍，以粗品的浓度计）。每天灌胃1 次，空白对照组给予生理盐水，连续30 d。在末次灌胃15 min 后，分别进行戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验和延长戊巴比妥钠睡眠时间实验。本研究的动物实验方案获得哈尔滨工业大学实验动物福利伦理审查委员会批准（批准编号：（IACUC-2021075），并且严格按照哈尔滨工业大学实验动物福利伦理审查委员会的管理要求进行实验操作。

1.2.3.1 戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验 给各实验组按32 mg/kg 体质量的剂量腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.1 mL/10 g 体质量，以小鼠翻正反射消失达1 min 以上为入睡判断标准，记录各组入睡动物数和睡眠发生率。

1.2.3.2 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 给各实验组按290 mg/kg 体质量的剂量腹腔注射巴比妥钠，注射量为0.1 mL/10 g 体质量，以小鼠翻正反射消失为指标，观察受试物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。

1.2.3.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间实验 给各实验组按41 mg/kg 体质量的剂量腹腔注射戊巴比妥钠，注射量为0.1 mL/10 g 体质量，以小鼠翻正反射消失为指标，观察受试物能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。

1.3 数据处理

实验所有数据测定三次，绘图采用GraphPad Prism 7 软件，响应面分析软件为 Design Exper.V 8.0.6.1，采用IBM SPSS Statistics 26 进行显著性分析和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 复合酶添加量的影响 复合酶添加量对出粉率和芦笋皂苷含量的影响结果如图1 所示。随着复合酶添加量的增多，出粉率和皂苷含量均呈现明显增加趋势，特别是0.04%至0.10%区间，二者增加趋势明显。当复合酶添加量达到0.12%时，出粉率和皂苷含量分别为39.3%和17.9%。而当复合酶添加量继续增加后，二者增加趋势均十分缓慢并趋于平缓。这可能是因为酶的浓度受到添加量的影响，随着酶浓度的增加，复合酶酶解速率增加，导致出粉率和皂苷含量增加，但当添加量过多时，酶的浓度达到饱和状态，从而抑制了酶解作用。故在本实验的考察范围内复合酶的最佳添加量为0.12%。

图1 复合酶添加量对出粉率和芦笋皂苷含量的影响Fig.1 Effect of compound enzyme addition amount on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.2 酶解温度的影响 酶解温度对出粉率和芦笋皂苷含量的影响结果如图2 所示。自55 ℃开始，随着酶解温度的增加，出粉率和皂苷含量都是先明显增加，70 ℃以后则均开始快速减少，此时出粉率和皂苷含量分别为39.5%和19.5%。这一现象可能是因为在初始阶段，随着温度升高后会增加酶的活性，从而加速酶解效率。但超过一定的温度后，酶蛋白分子就会发生失活变性，从而失去酶解作用。可见温度过低或过高均不利于酶解反应的发生。故在本实验的考察范围内最佳酶解温度为70 ℃。

图2 酶解温度对出粉率和芦笋皂苷含量的影响Fig.2 Effect of enzymolysis temparature on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.3 酶解时间的影响 酶解时间对出粉率和芦笋皂苷含量的影响结果如图3 所示。随着酶解时间的延长，出粉率和皂苷含量均逐渐升高。当酶解达到2.0 h 后，出粉率和皂苷含量分别达到40.1%和21.7%。随着酶解时间延长，二者增加趋势均十分缓慢并趋于平缓。酶解3.0 h 后，出粉率和芦笋皂苷含量与2.0 h的值变化不明显。这可能是因为随着酶解时间的增加，复合酶对植物细胞壁的作用不断加大，使其充分发挥酶解作用。但是当底物完全被耗尽后，即使继续增加酶解时间，出粉率和芦笋皂苷含量也会不再增加。故在本实验的考察范围内最佳酶解时间为2.0 h。

图3 酶解时间对出粉率和芦笋皂苷含量的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the powder yield and total saponins from asparagus

2.1.4 pH 的影响 pH 对出粉率和芦笋皂苷含量的影响结果如图4 所示。当pH 达到4.4 时，出粉率和芦笋皂苷含量开始明显增加，在pH5.2 时达到最大值，出粉率和皂苷含量分别达到41.2%和21.5%。而后又开始呈现明显下降趋势。可见酶解过程中的pH 对最终的出粉率和芦笋皂苷含量均有明显影响，这是因为pH 影响着酶的活性，适宜的pH 有利于酶和底物结合，pH 过低或过高均不利于酶解反应的发生，甚至有一定的抑制作用。故在本实验的考察范围内最佳pH 为5.2。

图4 pH 对出粉率和芦笋皂苷含量的影响Fig.4 Effect of pH on the powder yield and total saponins from asparagus

2.2 响应面试验结果

根据单因素实验结果，以复合酶添加量、酶解温度、酶解时间和pH 作为因素，以出粉率和芦笋皂苷含量为响应值，用Box-Behnken 设计试验，试验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of RSM

2.2.1 酶解工艺条件对出粉率的影响 以出粉率为响应值，建立酶解工艺参数回归模型。回归方程为：

Y1=43.20+0.24A−0.68B+0.97C+0.47D−0.25AB−0.30AC−0.28AD−1.47BC−0.83BD−0.85CD−1.92 A2−1.61B2−1.85C2−2.19D2

该方程的决定系数R2=0.9804，变异系数（C.V.）为0.93，在可接受范围内。方差分析结果详见表3。

表3 出粉率的回归方程方差分析Table 3 Regression equation variance analysis of powder yield

由表3 分析结果可知，F模型=49.94，整体模型极为显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.1015>0.05），说明方程和试验拟合较好。该模型的调整相关系数（R2Adj=0.9607）接近1，说明变量间的线性相关程度密切。本试验的噪音信号比（Adeq Precision=23.717）大于4，说明模型的信号适中，可对试验结果进行准确预测。综上所述，该试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。

由回归方程系数显著性检验可知，该模型的一次项B、C、D 和二次项A2、B2、C2、D2对出粉率的影响极显著（P<0.01），一次项A 影响显著（P<0.05）。交互项BC、BD 和CD 影响极显著（P<0.01）。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较可知，对出粉率影响作用的大小顺序为：C>B>D>A，即酶解时间>酶解温度>pH>复合酶添加量。

响应面图形是响应值对各试验因子A、B、C、D 构成的三维空间的曲面图。通过模型方程所得的具有极显著影响的响应曲面图和等高线图如图5 所示。3 个响应面均为开口向下的凸形曲线，说明响应值存在极大值。此外，酶解温度和酶解时间（BC）、酶解温度和pH（BD）、酶解时间和pH（CD）的响应面图的坡度均趋势陡峭，且等高线较密集，表明3 因素之间的交互作用对出粉率的影响较大，交互作用显著，与方差分析结果一致。

图5 酶解温度、酶解时间和pH 对出粉率影响的响应图和等高线图Fig.5 Response surface and counter showing the interactive effects of enzymolysis temperature,time and pH on the powder yield

2.2.2 酶解工艺条件对皂苷含量的影响 以皂苷含量为响应值，建立酶解工艺参数回归模型。回归方程为：

Y2=21.82+0.19A−0.28B+0.48C+0.27D−0.28AB−0.15AC+0.000AD−0.82BC−0.45BD−0.55CD−0.81A2−0.90B2−0.74C2−1.15D2

该方程的决定系数R2=0.9445，变异系数（C.V.）为1.57，在可接受范围内。方差分析结果详见表4。

表4 皂苷含量的回归方程方差分析Table 4 Regression equation variance analysis of saponin content

由表4 分析结果可知，F模型=17.03，整体模型极为显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.9624>0.05），说明方程和试验拟合较好。该模型的调整相关系数（R2Adj=0.8891）接近1，说明变量间的线性相关程度密切。本试验的噪音信号比（Adeq Precision=13.851）大于4，说明模型的信号适中，可对试验结果进行准确预测。综上所述，该试验结果可靠，本试验所得二次回归方程能很好地对响应值进行预测。

由回归方程系数显著性检验可知，该模型的一次项B、C，交互项BC、CD 以及二次项A2、B2、C2、D2对皂苷含量的影响极显著（P<0.01），一次项D 和交互项BD 影响显著（P<0.05）。对一次项回归系数的绝对值大小进行比较可知，对皂苷含量影响作用的大小顺序为：C>B>D>A，即酶解时间>酶解温度>pH>复合酶添加量。

响应面图形是响应值对各试验因子A、B、C、D构成的三维空间的曲面图。通过模型方程所得的具有显著性和极显著性影响的响应曲面图和等高线图如图6 所示。3 个响应面均为开口向下的凸形曲线，说明响应值存在极大值。此外，酶解温度和酶解时间（BC）、酶解温度和pH（BD）、酶解时间和pH（CD）的响应面图的坡度均趋势陡峭，且等高线较密集，表明3 因素之间的交互作用对皂苷含量的影响较大，交互作用显著，与方差分析结果一致。

图6 酶解温度、酶解时间和pH 对皂苷含量影响的响应图和等高线图Fig.6 Response surface and counter showing the interactive effects of enzymolysis temperature,time and pH on the saponin content

2.2.3 酶解工艺条件验证实验 在选取的各因素范围内，由Design Exper.V 8.0.6.1 软件处理后，经对两个响应值的结果进行拟合，分析得到的酶解最佳工艺条件为：复合酶添加量0.12%，酶解温度67.88 ℃，酶解时间2.23 h，pH5.24，模型预测的出粉率为43.60%，皂苷含量为22.0%。考虑实际操作的可信性，选取条件为：复合酶添加量为0.12%，酶解温度为68 ℃，酶解时间为2.2 h，pH 为5.2。为验证预测结果的可行度，在该最佳条件下做3 次平行实验，得到的实际值为：速溶芦笋粉出粉率42.7%，皂苷含量21.4%，与理论预测值基本一致（误差在3%以内）。因此，经响应面优化所得的酶解工艺条件参数准确可靠，具有一定的实际指导意义。

2.3 速溶芦笋粉干预小鼠睡眠功能实验结果

2.3.1 速溶芦笋粉对小鼠体重的影响 如图7 所示，与空白组和阳性对照组相比，各剂量组小鼠的初始体重和终止体重均无显著差异（P>0.05）。此外，在给予受试物1.0 h 内各组均未出现直接睡眠情况，符合《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中相关规定。

图7 受试物对小鼠体重的影响Fig.7 The effect of test drug on body weight of mice

2.3.2 速溶芦笋粉对小鼠睡眠发生率的影响 如图8所示，空白组小鼠无一入睡，睡眠发生率为0%。与空白组相比，当速溶芦笋粉作用浓度在50～200 mg/kg·bw范围内时，低、中、高剂量组对小鼠的睡眠发生率分别为26.7%、36.7%和43.3%，各剂量组均能极显著增加小鼠睡眠发生率（P<0.001），且速溶芦笋粉的刺激作用呈浓度依赖性。另外，中剂量组（100 mg/kg·bw）小鼠的睡眠发生率与阳性对照组基本一致。以上结果表明速溶芦笋粉具备良好的催眠效果。

图8 受试物对小鼠睡眠发生率的影响Fig.8 The effect of test drug on sleeping rate of mice

2.3.3 速溶芦笋粉对小鼠睡眠潜伏期的影响 如图9所示，空白组小鼠的自然睡眠潜伏期为35.73 min。与空白组相比，当速溶芦笋粉作用浓度在50～200 mg/kg·bw 范围内时，小鼠睡眠潜伏期分别减少了6.76 min（P<0.05）、9.43 min（P<0.001）和10.6 min（P<0.001），速溶芦笋粉的刺激作用呈浓度依赖性。另外，中、高剂量组小鼠的睡眠潜伏期与阳性对照组基本一致。以上结果表明，速溶芦笋粉具备良好的降低睡眠潜伏期的效果。

图9 受试物对小鼠睡眠潜伏期的影响Fig.9 The effect of test drug on sleeping delitescence of mice

2.3.4 速溶芦笋粉对延长小鼠睡眠时间的影响 如图10 所示，空白组小鼠的睡眠时间一般为29.47 min。与空白组相比，当速溶芦笋粉作用浓度在50～200 mg/kg·bw 范围内时，小鼠睡眠时间分别增加了6.93 min（P<0.01）、10.06 min（P<0.001）和17.16 min（P<0.001），速溶芦笋粉的刺激作用呈浓度依赖性。另外，中、高剂量组小鼠的睡眠潜伏期与阳性对照组基本一致。以上结果表明，速溶芦笋粉具备良好的延长小鼠睡眠时间的效果。

图10 受试物对延长小鼠睡眠时间的影响Fig.10 The effect of test drug on prolonged sleep time of mice

3 结论

本研究通过单因素实验和Box-Behnken 试验，得出速溶芦笋粉最佳酶解工艺条件为：复合酶添加量0.12%、酶解温度68 ℃、酶解时间2.2 h、酶解pH5.2，在此条件下速溶芦笋粉出粉率为42.7%，皂苷含量为21.4%。在本实验条件下建立的二次回归模型准确，拟合性较好。此外，利用该最佳工艺条件制备的速溶芦笋粉，研究其改善小鼠睡眠的功能。结果表明，该速溶芦笋粉的低、中、高剂量组对小鼠的睡眠发生率、睡眠潜伏期和睡眠时间均显著优于空白对照组（P<0.05），助睡眠作用效果呈剂量依赖性增强。本研究的开展可为芦笋速溶粉的工业化生产提供一定的理论指导，也为芦笋皂苷的助睡眠机理研究奠定了良好的基础，同时对于芦笋系列产品的精深开发起到了较好的推动作用，具有较高的科研价值和社会经济效益。