孔素芬，朱明明，朱建国，方曙光

（武汉微康益生菌研究院有限公司，湖北武汉 430000）

凝结魏茨曼氏菌（曾用名凝结芽孢杆菌）是一种既能产乳酸又能产芽孢的革兰氏阳性细菌，最早于1915 年由Hammer[1]分离得到。凝结魏茨曼氏菌是美国食品和药物管理局（FDA）和欧盟食品安全局（EFSA）共同认证的可以安全使用的益生菌。同时，凝结魏茨曼氏菌也列入了Generally Recognized As Safe（GRAS 普遍公认安全）和Qualified Presumption of Safety（QPS 合格安全推定）菌株名单。此外，美国食品药品监督管理局（FDA）和美国饲料控制官员协会也将凝结魏茨曼氏菌列入到可用于饲料的安全微生物菌种名单[2−3]。

近年来，凝结魏茨曼氏菌作为新型微生态制剂，由于其益生作用和高抗逆特性，在畜牧[4]、水产养殖[5]、农业[6]和环境保护[7]等行业中被广泛应用。刘彬等[8]发现凝结魏茨曼氏菌增加异育银鲫幼鱼血液中髓过氧化物酶和抗超氧阴离子自由基活性，有效缓解宿主重金属中毒反应。苗华彪等[9]研究发现凝结魏茨曼氏菌在生猪养殖应用中具有改善生猪肠道健康、提高机体免疫力和抗病能力、调节肠道菌群平衡和提高动物生产性能等作用。可见凝结魏茨曼氏菌作为一种新的微生态制剂正在成为一种趋势。但是由于菌株的挑选不规范，菌株配伍不科学，是否具有耐药性等依然影响着微生态制剂的应用与发展。本研究对一株从仔猪粪便中分离获得的凝结魏茨曼氏菌进行了形态特征的观察，评价了该菌株的益生特性和安全性，同时，初步考察了与其他饲用益生菌的复配情况，证明其具备开发利用和研究价值，为凝结魏茨曼氏菌进一步的功能评价、应用扩展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

病原菌：大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、肠炎沙门氏菌ATCC14028、福氏志贺氏菌ATCC12022、化脓性链球菌ATCC19615

购于广东微生物菌种保藏中心；干酪乳杆菌W189、乳酸片球菌W172、嗜酸乳杆菌W211、屎肠球菌W362、粪肠球菌W471 武汉微康益生菌研究院实验室分离、编号、保藏；仔猪粪便 采集自湖北省种猪养殖场断奶仔猪；小鼠 购自华中农业大学实验动物中心，实验动物使用许可证号为SYXK(鄂）2020-0084，小鼠实验伦理审批编号为HZAUMO-2023-0140；蛋白胨、酵母粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、NaCl、CaCO3、硫酸铵（均为分析纯试剂）、猪胆盐（胆酸含量≥60%）国药集团化学试剂有限公司；胃蛋白酶（1:3000）上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂为分析纯试剂。

JY10002 型电子天平 上海衡平仪器仪表厂；SW-CJ-2FD 型双人单面超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SPX-250B-2 型恒温培养箱 上海福玛实验设备有限公司；CX-23 显微镜 奥林巴斯公司；UV-1700 紫外分光光度计 上海美析仪器有限公司；pHS-3C 型pH 计 上海仪电科股份有限公司公司；D（24 L）型高压蒸汽灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；DK-8D 型水浴加热锅 常州国宇仪器制造有限公司；5415D 台式冷冻离心机 德国Eppendorf 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基和溶液配制 MRS 培养基（g/L）：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，柠檬酸氢二铵2 g，无水乙酸钠5 g，MgSO40.2 g，MnSO40.6 g，Tween 80 1 mL，蒸馏水1000 mL，pH6.0～6.2，115 ℃，30 min 灭菌。

平板筛选培养基参考辛国芹等[10]报道筛选培养基：MRS 培养基基础上添加0.25% CaCO3和1.5%琼脂粉。

发酵培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.2 g，硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾4 g，水1000 mL，pH6.8～7.0，115 ℃灭菌 30 min。

PCA 培养基：葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，酵母浸粉2.5 g，琼脂粉1.8 g/L，水 1000 mL，pH7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。

胃液配制[11]：NaCl 0.5%、胃蛋白酶 0.3%，用1 mol/L HCl 调节pH 至3.0，用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后备用。

胆盐培养基[12]：取一定量的猪胆盐加入含0.2%（w/v）的巯基乙酸钠的MRS 培养基中，使胆盐终浓度（g/mL）分别为0%，0.1%，0.3%，0.5%，1.0%，用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.2.2 菌株的筛选与鉴定

1.2.2.1 菌种初筛纯化 采集健康仔猪粪便样品10 份，各取样品1 g 分别放入装有 9 mL 无菌生理盐水50 mL 离心管中，振荡15 min，使之充分混匀，静置20～30 s，每个样品吸取2 mL 悬液置于80 ℃水浴处理10 min[13]，分别取1 mL 进行10 倍梯度稀释，再选择适宜梯度的悬液涂布于含0.25%碳酸钙的MRS 琼脂培养基上，置于37 ℃培养箱恒温培养48～72 h。挑取初筛平板不同形态的单菌落在PCA培养基平板上反复划线纯化，单菌落形态稳定后，编号保存。

1.2.2.2 菌株形态学观察 平板菌落观察：观察菌落形态、大小、颜色、凸起有无等；菌体形态观察：观察油镜下菌体的形态、大小、排列等；扫描电镜观察：观察扫描电镜下放大20000 倍菌体的立体形态、芽孢着生特点等。

1.2.2.3 16S rDNA 序列分析及系统发育树构建 使用通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT 进行PCR 扩增。PCR 反应体系：2×Buffer MIX 25 μL，引物27F 和1492R 各2 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 补足至50 μL。PCR 反应条件：94 °C 3 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。将PCR 产物通过凝胶电泳检测后，产物送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将测得基因序列提交至NCBI 数据库中进行BLAST 分析比对，以16S rDNA 序列同源性≥99%为鉴定标准。

1.2.3 生理生化实验 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。

1.2.4 生长特性的初步探究 将凝结魏茨曼氏菌单菌落接种至MRS 液体培养基进行二级活化，按照5%接种量接入装有30 mL 发酵培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃，250 r/min，摇床培养，以pH、OD 值为指标，观察菌株24 h 的生长特性。

1.2.5 抗逆性实验

1.2.5.1 培养液制备 取BC66 甘油管接种至30 mL MRS 液体培养基中进行一级活化，37 ℃，250 r/min摇床培养12～15 h，取一级培养液按5%接种量接入装有30 mL 发酵培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃，250 r/min，摇床培养18～24 h 得到所需培养液。

1.2.5.2 耐酸实验 取1 mL 培养液10000 r/min 离心1 min 后去上清加入10 mL pH3.0 的模拟胃液，置于37 °C 培养箱恒温孵育，分别于0、2、3、4 h 不同耐受时间取样进行活菌计数。以0 h 测定值作为空白对照，计算菌株存活率。

其中，N1表示经过处理后菌株体系中的活菌数，CFU/mL；N0表示菌株体系中初始活菌数，即0 h测得的活菌数，CFU/mL。

1.2.5.3 耐胆盐实验 取1 mL 培养液10000 r/min离心1 min 后去上清分别加入不同胆盐浓度0.1%、0.3%、0.5%、1.0%（w/v）的10 mL 胆盐培养基，置于37 °C 恒温培养，分别于0、2 h 取样进行活菌计数。以0 h 测定值作为空白对照，计算菌株存活率。

其中，N1表示经过处理后菌株体系中的活菌数，CFU/mL；N0表示菌株体系中初始活菌数，即0 h测得的活菌数，CFU/mL。

1.2.5.4 耐高温实验 将凝结魏茨曼氏菌菌株接种至PCA 固体斜面培养基上，菌体培养至形成芽孢后，取菌苔制成悬液各2 mL，分别置于70、80、90、100 ℃水浴中处理10 min，处理完后立即冷却，取0.1 mL 悬液进行梯度稀释活菌计数，以未水浴菌液为对照，培养48 h 后计算存活率[14]。

其中，N1表示水浴中处理10 min 后的活菌数，CFU/mL；N0表示未水浴菌液的活菌数，CFU/mL。

1.2.6 体外抑菌实验 采用琼脂扩散法[15]，按1.2.5培养液制备方法进行二级活化，二级培养液37 ℃250 r/min 摇瓶培养10～15 h，离心收集上清液。指示菌采用LB 液体培养基进行培养，在 37 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养 24 h，制成1×108CFU/mL 菌悬液。指示菌悬液按1:100 的比例加入LB 琼脂培养基溶液中，充分混匀后倾注加到放置牛津杯的平板中，凝固后取出牛津杯。将200 μL 上清液加入到7 mm 的孔中，以空白LB 培养基为阴性对照，37 ℃培养适宜时间后，测量抑菌圈的大小，检测加入培养上清液对指示菌的抑制作用。

1.2.7 凝结魏茨曼氏菌与不同菌株的拮抗关系 参考徐秀伟[16]采用的菌种划线拮抗方法，分别将凝结魏茨曼氏菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、屎肠球菌，粪肠球菌的甘油管菌种接种至MRS 液体培养基过夜培养，取不同菌株菌液离心，留菌体。将凝结魏茨曼氏菌分别和干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌、屎肠球菌，粪肠球菌在平板上两两呈“井”字划线，观察交叉菌线生长状况，是否出现透明圈，以此判断两个菌株间是否存在拮抗作用。

1.2.8 安全性评价

1.2.8.1 溶血性实验 取1.2.5 离心后的凝结魏茨曼氏菌菌体以划线的形式接种在含1.5%琼脂和5%脱纤维羊血的血液琼脂（BHI 培养基）中37 ℃培养48 h，观察溶血情况。在菌落周围产生绿色带（α-溶血）或在血平板上不产生任何溶血（γ-溶血）的菌株被认为是非溶血的，菌落周围出现溶血带（透明色带）的菌株被归类为具有溶血（β-溶血）特性的微生物，出现透明β-溶血环为溶血表型阳性，使用化脓性链球菌作为阳性质控菌株[17]。

1.2.8.2 抗生素敏感实验 采用纸片扩散试验法[18]。将200 μL 含108CFU/mL 的凝结魏茨曼氏菌发酵液均匀涂布于MRS 琼脂平板上，待平板表面稍干后，放入常用抗生素药敏纸片，贴在培养基表面中央，轻轻按压纸片使其固定。在37 ℃培养24 h 后，测量抑制圈直径大小。

1.2.8.3 急性毒性实验 安全性评价采用急性毒性实验，参照GB15193.9-2014 最大耐受剂量法进行。取体重18～22 g 的小鼠雌雄各15 只，观察3 d 后，1 日内分2 次经口给予0.2 mL 注菌液（按小鼠体重20 g计算相当于每千克体重20 mL），连续灌胃14 d，观察小鼠是否有中毒和死亡现象。注菌液使用0.85%生理盐水制成含量为1×109CFU/mL 的凝结魏茨曼氏菌悬液[19]。

1.3 数据处理

所有检测实验均重复3 次，结果均以平均值±标准差表示。原始数据用Excel 2010 整理后采用统计学软件SPSS statistics 21.0 进行差异显著性分析，比较实验中不同处理间差异。P<0.05 认为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选与鉴定

2.1.1 菌株的形态学特征及鉴定结果 对获取的10 份仔猪粪便样品进行热处理，并利用菌株的耐高温特性获取芽孢杆菌4 株，经鉴定分别为凝结魏茨曼氏菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，具体结果见表1 和图1。

图1 不同芽孢杆菌的单菌落形态Fig.1 Single colony of different Bacillus

表1 不同芽孢杆菌菌落形态Table 1 Morphological characteristies of different Bacillus

2.1.2 形态特征观察 将获得的凝结魏茨曼氏菌在PCA 平板上进行稀释涂布，得到纯化后的菌株并编号为BC66，菌落形态如图2 所示。对菌落进行革兰氏染色在光学显微镜下观察细胞形态特征，10×100光学显微镜观察菌体形态呈杆状，芽孢端生。20000 倍扫描电镜状态下观察，芽孢一端膨大，呈鼓槌状。菌株个体形态如图3 所示。

图2 菌落形态Fig.2 The morphology of the colony

图3 BC66 细胞形态Fig.3 The cellular morphology of BC66

2.1.3 16S rDNA 序列分析及系统发育树构建 使用通用引物对BC66 进行PCR 扩增，PCR 产物通过凝胶电泳检测后，产物送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将测得基因序列提交至NCBI 数据库中进行BLAST 分析比对，通过比对确定菌株BC66 为凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），曾用名为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。比较分析同源性较高的序列，构建出凝结魏茨曼氏菌的系统发育树，见图4。以Paenibacillus agarexedensDSM 1327（MT568608）为外枝构建的Neighbor-Joining 系统发育树，BC66 与凝结魏茨曼氏菌标准菌株ATCC7050的16S rDNA 序列同源性99.68%，使用MEGA Ⅹ 对菌株与其他菌株进行16S rDNA 序列一起构建遗传进化树，可以看到BC66 与凝结魏茨曼氏菌标准菌株亲缘关系较近，处于同一分支。

图4 基因序列比对结果Fig.4 The results of gene sequence alignment

2.1.4 生理生化实验 生理生化指标是进行细菌分类的重要依据，BC66 菌株主要依据《伯杰细菌鉴定手册》[20]的分类原则进行，菌株的生理生化特征如表2 所示。

表2 BC66 的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of BC66

从表2 可以看出菌株BC66 能利用葡萄糖产酸，尿酶反应阴性，不产H2S，吲哚实验阴性。

2.2 生长特性初步探究

将筛选到的BC66 菌株进行初步的生长特性研究，分别在0、3、9、15、18 及24 h 取样测定OD 值和pH，观察菌株培养24 h 的生长特性。

微生物的生长繁殖分为4 个时期，分别为停滞期、对数期、稳定期、衰亡期[21]，从图5 可以看出，活化后的菌株转入到新鲜培养基后停滞期较短，18 h达到对数生长末期，之后进入稳定期。从pH 变化曲线来看，菌株BC66 的发酵液pH 在15 h 达到最低点4.61，辛国芹等[10]研究发现，凝结魏茨曼氏菌在代谢中产生有机酸，主要为乳酸和乙酸。乳酸和乙酸对于提高饲料消化率，降低胃部及后肠道pH，抑制有害菌及腐败菌的生长繁殖，维持肠道有益微生物的生长，同时抑制肠道致病菌，改善肠道环境具有重要作用[22]。

图5 BC66 生长趋势图Fig.5 The growth trend of BC66

2.3 抗逆性研究

2.3.1 耐酸特性 菌株的耐酸特征决定其通过胃液在肠道中的存活能力。正常情况下，胃酸 pH2.0～3.0，食物通过胃排空时间一般在2～4 h[23]。实验研究了菌株在pH3.0 酸性条件下的存活情况。图6 显示了不同耐受时间凝结魏茨曼氏菌BC66 菌株生长情况。结果表明，该菌株在pH3.0 的模拟胃液中处理2 h时，菌株存活率可达98%；处理4 h 时，菌株存活率还保持在60%以上。说明菌株BC66 具有较强的耐酸能力，在通过胃液时，能有足够数量的活菌在胃肠道中发挥益生作用。

图6 BC66 在pH3.0 酸性条件下的耐受情况Fig.6 Tolerance of BC66 in pH3.0 acidic condition

2.3.2 耐胆盐特性 胆盐是肠道中参与机体营养消化和吸收的主要成分。益生菌在肠道中存活和定殖，必须能对小肠中的胆汁有抗性。肠道中的胆盐浓度不是固定不变的，胆盐浓度主要在0.03%～0.3%范围内波动[24]。若菌株在该条件下能存活才有可能正常生长代谢[25]，菌株耐胆盐的特性决定了其在肠道中的存活能力。实验研究了菌株对不同浓度胆盐的耐受能力，实验结果如图7 所示，在0.3%胆盐浓度下，菌株存活率为79%，在0.5%胆盐浓度下其存活率保持在63%。说明菌株BC66 具有较好的胆盐耐受性，能在肠道中生长，并发挥益生作用。

图7 BC66 在不同胆盐浓度中存活情况Fig.7 Survival of BC66 in different bile salt concentrations

2.3.3 耐高温实验 高温在实际生产中会影响产品的活性，同时也是影响产品稳定性的重要因素，凝结魏茨曼氏菌由于其芽孢具有良好的抗逆性，能耐受工业生产中的高温高压等不利环境[26]，本研究对BC66的耐高温特性进行考查，将芽孢菌悬液分别置于不同温度水浴中处理10 min 后，进行梯度稀释活菌计数，结果见图8，水浴温度90 ℃处理10 min 菌体存活率达到92%，水浴温度为100 ℃时，菌体存活率还保持约50%，金迅等[27]研究显示凝结魏茨曼氏菌13002 在80 ℃条件下存活率可达到72%，远低于本研究中的80 ℃高温处理后的存活率96%，表明凝结魏茨曼氏菌BC66 具有较强的耐高温特性，在益生菌产品加工应用领域具有更大的多样性[28]。

图8 BC66 耐高温存活率情况Fig.8 High temperature survival rate of BC66

2.4 体外抑菌实验

有动物饲养试验显示，饲料中添加凝结魏茨曼氏菌能抑制大肠杆菌、沙门氏菌等肠道主要有害菌，显著改善畜禽生长性能[29−31]，本研究对凝结魏茨曼氏菌进行常见病原菌体外抑菌实验，结果见表3，菌株BC66 对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，肠炎沙门氏菌，福氏志贺氏菌均表现出不同程度的抑菌能力，与陈宇等[32]报道一致，凝结魏茨曼氏菌可分泌多种凝固素、双乙酰、L-乳酸等抑菌物质，能抑制肠道内大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌等有害菌。

表3 BC66 抑制病原菌作用Table 3 Antigonistic acticity of BC66

2.5 BC66 与其他乳酸菌的拮抗关系

凝结魏茨曼氏菌对肠道有害菌及饲料源有害菌[33]抑制作用的研究较多，对多种商业饲用益生菌的研究报道较少，考虑到商业复合饲用益生菌在凝结魏茨曼氏菌与其他饲用益生菌菌株之间可能的拮抗效应[34]，本研究初步考查了BC66 和干酪乳杆菌W189、嗜酸乳杆菌W211、乳酸片球菌W172、屎肠球菌W362、粪肠球菌W471 的拮抗作用，结果如图9所示，横向划线的菌株为BC66，纵向划线的菌株为不同的益生菌，从图中可以看出BC66 与干酪乳杆菌W189、嗜酸乳杆菌W211、乳酸片球菌W172 不存在拮抗关系，和粪肠球菌W471、屎肠球菌W362 存在较弱拮抗作用。

图9 BC66 与几株常规益生菌之间的拮抗作用Fig.9 The results of antagonism between BC66 and several strains of probiotics

2.6 安全性评价

2.6.1 溶血性实验 如图10 所示，BC66 周围未出现透明溶血圈，而作为阳性质控菌株的化脓性链球菌在血琼脂平板上出现了透明的溶血圈，表明凝结魏茨曼氏菌BC66 没有溶血活性。

图10 溶血性实验结果Fig.10 The results of the hemolytic test

2.6.2 抗生素敏感性评价 抗生素敏感性实验是考察益生菌安全性的重要检查指标，如果菌体对抗生素敏感，说明细菌细胞中不存在抵抗这种抗生素的基因。参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物药物敏感实验执行标准[35]，对15 种抗生素进行了耐抗生素的敏感性实验研究，由表4 可知，凝结魏茨曼氏菌BC66 对15 种抗生素均处于敏感状态，此菌株不具有耐药性，可认为是安全菌株。

表4 BC66 对常用抗生素的敏感程度Table 4 The antibiotic susceptibility of BC66

2.6.3 急性毒性实验 观察饲喂后的小鼠活力情况，所有小鼠生命体征活跃，未见不良反应，均未出现中毒和死亡现象，说明菌株BC66 在GB15193.9-2014推荐剂量下进行急性毒性实验无显性致死作用。此外，毒理学实验和大量临床观察表明凝结魏茨曼氏菌是安全菌种，没有致突变性、致畸性和遗传毒性[36]。

3 结论

本研究从健康仔猪粪便中分离筛选到一株耐高温，产乳酸的凝结魏茨曼氏菌BC66，并对其作为益生菌的潜力和安全性进行了初步研究和评价。结果表明该菌株在胃肠道苛刻条件（pH3.0；胆盐 0.3%）下具有较强的生存能力，表现出良好的抗病原菌活性和抗生素敏感性，且没有溶血活性。此外，该菌株产生抗逆性很强的芽孢，在90 ℃下处理10 min 还能保持较高的活性，能够抵御高温食品和饲料生产的工业化过程，可作为潜在的益生菌产品应用于食品、饲料等领域。综上所述，本研究从自然界分离到的新菌株凝结魏茨曼氏菌BC66 具有在饲料工业中应用的明显优势和潜力。然而，进一步的体内实验和相关基因功能分析仍然需要开展，以期对该菌株的优良性状进行全面评价，为芽孢益生菌的开发应用奠定理论基础。