孙 弦 刘 睿 高 虎 胡 珍 吴 庭

(武汉市第三医院皮肤科,湖北省武汉市 430000)

马尔尼菲篮状菌病(Talaromycesmarneffeidisease,TSM)常见于免疫功能低下人群,尤其是艾滋病患者。有报告显示,在广西艾滋病合并马尔尼菲篮状菌感染患者约占全部艾滋病患者的20%[1]。但近年来TSM在正常人群中的发病率逐渐增高[2]。TSM起病初期无显著特征,容易漏诊、误诊,而该病的病死率达80%及以上[3],早期诊断、早期治疗可降低该病的病死率。目前对马尔尼菲篮状菌的检测方法主要以免疫学实验为主,但真菌的抗原弱,且机体的免疫状态影响抗体的产生,导致其诊断的准确性不高。研究表明,马尔尼菲篮状菌的实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)扩增产物与Pm3杂交有较高的特异性,PCR技术诊断马尔尼菲篮状菌具有较高的敏感度及特异度[4]。序列特异性核酸体外扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一种新型的RNA扩增技术,可在短时间内迅速扩增RNA,且无需特殊检测仪器[5]。本研究探讨NASBA与RT-qPCR技术对马尔尼菲篮状菌的检测价值。

1 资料与方法

1.1 样本来源 收集2017年12月至2020年1月我院收治的40例HIV阴性TSM患者的临床资料,其中男性27例、女性13例,年龄24～53(43.24±11.24)岁,所有患者均存在肩部病灶。40例患者中,合并β型地中海贫血8例,临床表现为右髋关节痛2例、发热3例、胫骨前皮肤出现脓点1例、右上肢皮肤圆形红斑2例,TSM确诊依据为血培养阳性;合并分枝杆菌感染7例,临床表现为咳嗽、咳痰、气喘4例,四肢、躯干散在皮疹2例,皮疹伴脱屑1例,TSM确诊依据为血培养阳性;合并分枝杆菌/败血症感染患者8例,临床表现为胸痛1例、发热2例、咳嗽2例、皮疹3例,TSM确诊依据为血培养阳性;合并肺结核感染者1例,临床表现为慢性咳嗽、咳痰急性加重,TSM确诊依据为血培养阳性;16例患者无合并感染,临床表现为全身红斑、丘疹6例,红色丘疹、小结节7例、发热2例,以及发热伴咳嗽、咳痰、淋巴结肿大1例,TSM确诊依据为皮疹培养阳性13例、临床诊断阳性3例。

1.2 检测方法

1.2.1 提取病理组织RNA:采集患者肩部病灶组织样本,加入1 200 μL无水乙醇,震荡后以3 000 r/min离心5 min,弃上清液,用乙醇清洗沉淀物后于常温孵育至乙醇全部蒸发,然后加入180 μL组织裂解缓冲液。严格按照RNA提取试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司,批号:wlb1384)说明书提取RNA,置于-80 ℃冰箱备用。

表1 引物和探针序列

1.2.3 NASBA检测:取1.2.1提取的RNA。NASBA扩增引物序列见表2。利用 Primer Premier 5.0软件设计合成引物,按照NASBA Lyophilized试剂盒[普瑞麦迪(北京)实验室技术有限公司,批号:LEM-5]说明书解冻反应缓冲液,混匀后装入PCR管。取10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL, 与2 μL 无菌去离子水混匀后装入PCR管, 再加入2 μL RNA模板。放入ABI7500型定量PCR(Applied Biosystems公司),65 ℃反应2 min、41 ℃反应10 min后,每个PCR管中加入预冷的冻干酶混合液5 μL,混匀后41 ℃继续反应90 min。取扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳。RT-qPCR与NASBA检测方法的详细参数见表3。

表2 引物序列

表3 RT-qPCR与NASBA检测方法参数的对比

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。真菌载量拷贝数以对数值(log/mL)进行统计。计量资料以(x±s)表示,组间比较采用两独立样本t检验;采用Pearson检验分析两种方法检测TSM患者真菌载量的相关性,采用Bland-Altman法分析两种方法检测TSM患者真菌载量的一致性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 RT-qPCR、NASBA检测TSM患者马尔尼菲篮状菌载量的比较 RT-qPCR检测的真菌载量为3.24～6.18(5.24±0.67)log/mL,NASBA检测的真菌载量为3.01～6.62(5.33±0.87)log/mL,两种方法检测的真菌载量差异无统计学意义(t=0.518,P=0.606)。其中1例TSM患者的真菌载量用RT-qPCR方法和NASBA方法检测分别为6.09 log/mL和4.74 log/mL,差值为1.35 log/mL。

2.2 RT-qPCR、NASBA检测TSM患者马尔尼菲篮状菌载量的相关性分析 RT-qPCR与NASBA两种方法检测的真菌载量呈正相关(r=0.582,P=0.008)。

2.3 RT-qPCR、NASBA检测TSM患者马尔尼菲篮状菌载量的一致性分析 以两种方法检测的真菌载量均值为横轴,以差值为纵轴做Bland-Altman图,见图1。结果显示,全部数据差值为(-0.18±0.88)log/mL,95%一致性界限为(-0.88,0.88)log/mL,95%一致性界限内存在90%(36/40)的点,提示两种方法的检测结果具有较好的一致性。

图1 Bland-Altman图

2.4 RT-qPCR 、NASBA技术方法学的对比 在马尔尼菲篮状菌载量为2.81×1010拷贝/μL时NASBA可测出目的片段,而RT-qPCR隐约能看到条带,提示 NASBA 的灵敏度稍高,见图2。

图2 RT-qPCR、NASBA检测灵敏度的对比

3 讨 论

马尔尼菲篮状菌侵入机体后引起机体感染,可影响机体内多个器官的功能,导致TSM,其常见症状为发热、淋巴结及肝脏肿大、呼吸道异常等。由于该病初期无特异性特征,因此确诊困难,影响治疗效果[6]。研究表明,TSM患者的病理改变与机体免疫功能关系密切,免疫功能正常的马尔尼菲篮状菌感染者体内马尔尼菲篮状菌的数量较少,主要表现为炎性肉芽肿等,而免疫功能低下的患者体内存在大量马尔尼菲篮状菌,表现为无菌性坏死[7-9]。目前,主要以基于血标本、活检组织等样本的真菌涂片和培养作为诊断TSM的金标准,以病理学检查、血清学检测为辅助诊断方法[10-11]。由于TSM患者的病理特征与临床特点与结核分枝杆菌、荚膜组织胞浆菌较为相近,因此鉴别诊断困难。同时,马尔尼菲篮状菌与荚膜组织胞浆菌在感染组织中的形态、大小、染色相似,须进行真菌培养才可鉴别,但真菌培养的时间较长,导致患者的诊断时间延长,延误治疗[12-13]。血清半乳甘露聚糖试验是诊断TSM的常用方法之一,具有便捷、快速、无创等优点,但其敏感性低,容易受多种因素影响而出现假阳性与假阴性的结果[14]。因此,寻找高效、便捷的诊断方法,以提高TSM的诊断准确性具有重要的临床意义。

RT-qPCR与NASBA均属于靶核酸扩增技术。RT-qPCR检测主要是在PCR的反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号进行检测,最后通过标准曲线对目标基因进行分析,该方法具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点。有研究表明,RT-qPCR可有效地诊断由结核分枝杆菌感染、曲霉菌感染等疾病[15-16]。NASBA是以RNA为模板的一种酶促反应过程,可实时观察诊断结果[17]。虽然两种方法检测马尔尼菲篮状菌载量的下限不同,但均可准确地检测载量在50～1 000拷贝/mL范围内的样本[18]。郑艳青等[19]的研究结果显示,RT-qPCR能高效检测出皮肤病理组织及淋巴结活检组织中马尔尼菲篮状菌的载量,对马尔尼菲篮状菌感染的诊断有一定的价值。 严亚军等[20]发现, 在HIV-1型感染者病毒载量的检测中,RT-qPCR与NASBA的检测结果具有较好的相关性及一致性。本研究同时采用RT-qPCR、NASBA技术对TSM患者的肩部病灶组织进行马尔尼菲篮状菌载量的检测,结果显示两种方法检测的真菌载量差异无统计学意义(P>0.05),且两种方法检测马尔尼菲篮状菌的载量呈正相关,并具有较好的一致性,但NASBA的灵敏度稍高,这提示两种方法均可准确地检测出TSM患者的马尔尼菲篮状菌载量,或可用于TSM的诊断。

本研究中,采用RT-qPCR与NASBA技术检测时有1例患者的真菌载量差值>1个log/mL,分析原因可能与两种方法检测的靶点不同有关,RT-qPCR的检测靶点为马尔尼菲篮状菌感染患者的LTR区域,而NASBA的检测靶点为HIV-1 Gag区域。另外,可能也与患者感染的马尔尼菲篮状菌的亚型及序列存在差异,以及RNA提取及扩增系统的自动化程度有关,RT-qPCR检测属于完全自动化,而NASBA为半自动化[21-22]。因此,为了保证马尔尼菲篮状菌载量检测的准确性,建议检测同一患者在不同时间的真菌载量时采用同一种技术。

综上所述,RT-qPCR与NASBA检测HIV阴性TSM患者病灶组织的马尔尼菲篮状菌载量具有较好的相关性及一致性,但在相同的拷贝浓度下NASBA技术的灵敏度更高。