●陈泉佐 赵贤生 焦玉鹏 张棋淞 杨新丽 杨小军 姜 磊 张 磊 付顺华※

（1.浙江农林大学 林业与生物技术学院 浙江 杭州 311300；2.富阳区农业技术推广中心经作站 浙江 杭州 311400；3.浦江县俊果研究所 浙江 金华 322329；4.杭州富阳恒浩家庭农场 浙江 杭州 311402；5.浙江省桐乡第一中学 浙江 嘉兴 314500）

掌叶覆盆子（Rubus chingiiHu）是蔷薇科悬钩子属的一种藤状落叶灌木，又称掌叶复盆子、华东覆盆子，主要分布在中国华东地区。其成熟果实鲜红美艳，口感酸甜，风味独特。近成熟青果制干即为有悠久使用历史的中药材覆盆子。药理和化学成分研究表明，掌叶覆盆子根、叶、果均具有药用价值，有益肾、固精、缩尿、壮阳及养肝明目等作用[1]，可促进消化、缓解腹泻、补充铁质[2]，可用于治疗细胞的炎症反应[3]。掌叶覆盆子叶茶多酚含量接近于茶叶，且口感甘甜，有降血脂效果，制成茶剂或其他食品可满足高血脂人群需求[4]，并可使妇女子宫肌和骨盆肌肉保持正常，提高婴儿母乳营养价值，促进产妇母乳分泌[5]。掌叶覆盆子叶的乙醇提取物有显著的抗血栓作用，分离得到的山奈酚、槲皮素和椴树苷能明显延迟血液中血浆复钙时间[6]。同时掌叶覆盆子果实含有丰富的氨基酸和维生素，有抗衰老、保健、美容功效[7-9]，是一种亟待开发的健康功能植物。

20世纪90年代，国内悬钩子属植物受到人们关注，得到初级开发利用。人们开始对野生悬钩子植物进行驯化引种，并开展生物学基础、栽培性状等研究，其中重点开展对掌叶覆盆子的研究。从栽植环境、移栽时间和密度、苗期管理措施方面，探索掌叶覆盆子的栽培模式[1]；开展施肥用量和施肥时间等研究，了解合适施肥条件[10]；开展种苗繁殖和组培快繁研究，了解合适采种期、种子贮藏时间、催芽方式[11-13]和组织培养合适条件[7，14-15]；从化学成分和药理作用的深入研究中，发现果实、叶片中多种类的新型营养物质，包括糖类、有机酸类、维生素类成分和挥发性成分[16-17]，以及抑制原发性肝癌[18]、祛除黄褐斑等新功能[19]。

目前掌叶覆盆子良种选育已有一些初步研究[20-21]，主要是通过比较不同植株个体生长开花结实特性的变异选择优株，但少有进一步培育出生产上可利用的新品种的报道，涉及以皮刺为主要育种性状的掌叶覆盆子良种选育研究更是未见报道。半同胞子代有一半的遗传信息来源于母本，故能够较好地继承母本的优良特性，同时又有来自不同父本的遗传信息，会产生新的基因型和优良表现型。在半同胞子代群体中开展优株选择，可以有效选择到综合父母本双亲优良特性的个体，进而能培育性状更优良的品种或品系。本试验以在生产上开始推广应用的少皮刺型新品种“美赐”半同胞子代（以下简称“美赐”）的种子为材料，通过观测“美赐”种子特性、种子发芽特性、苗期形态特征、分枝特征和皮刺分布，了解其种子种苗生长特性，并开展苗期少（无）刺优良单株选择，为其后续品种升级换代、保纯防衰和创制种质资源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料“美赐”种子从以掌叶覆盆子新品种“美赐”植株为母本的自由授粉成熟果实中获得，普通种子从种植基地中的掌叶覆盆子栽培植株上获得。

2020年5月和2021年5月两次在金华市浦江县花桥乡掌叶覆盆子种植基地，选择生长良好的“美赐”植株和普通掌叶覆盆子植株分别取样。摘取果型饱满、颜色正常红艳的成熟果实，分别装入保鲜袋，做好标记，带回实验室即时进行称重，同时记录果实形态性状。随后对果实进行破碎，用水洗法去除果肉，分离种子，将得到的种子放在阴凉处风干。干燥后进行千粒重测定，随后将种子进行贮藏。

1.2 研究方法

1.2.1 试验地整理 2021年4月，在浙江农林大学平山试验基地的省级林木种质保育基地大棚内设置试验圃地。圃地土壤深耕，后将圃地杂草杂物清理，杀菌消毒，清除土壤病虫害。再在土壤上覆盖一层2 cm厚的泥炭土，随后喷水至圃地土壤完全湿润。

1.2.2 种子播前处理与播种 对2020年5月所采的贮藏后“美赐”种子，于播种前放入清水中浸泡4 h，使种子吸收足够的水分，促进种子萌发。圃地开播种沟，以条播方式进行播种。完成播种后，种子不覆土，轻度喷雾洒水湿润，使种子充分接触土壤。

1.2.3 苗期管理与病虫害防治 幼苗萌出后，观察其生长状况的同时，适时进行水分补充。定期喷雾浇水，以土壤不干为度，进行“美赐”苗期生长性状观测和成苗期优株选择群体。

2021年5～6月，发现小苗叶片有被食叶昆虫啃食迹象（图1），确认是短额负蝗（Atractomorpha sinensisB.）成虫和菜粉蝶（Pieris rapaeL.）幼虫，随后使用苏云金杆菌药剂灭虫，8～10 mL药剂加水制成1.5 L混合溶液，叶面喷洒，数天后叶片被啃食现象消失。当年8月，小苗叶面出现黄色病斑，使用链霉素药剂进行防治后，叶面黄色病斑逐渐减少。

图1 苗期食叶昆虫及危害状

1.2.4 性状观测

1.2.4.1 种子正常率与外观形态 在2021年5月所采“美赐”种子、普通种子中分别随机选取种子，用刀片小心切开硬种皮，观察种子内部种胚结构是否完整、正常，如果种胚白色、饱满，认为是正常种子；如果种胚黑色或棕色、干瘪状态，则认为是不正常种子。各随机选取30粒种子作为一组，各重复3次，记录观测数据。种子正常率计算公式如下：

其中，n为正常种子数，N为总解剖种子数。

使用电子游标卡尺测量种子纵径、横径和侧径。选择“美赐”种子和普通种子若干，各从中随机选取10粒种子，分别测定种子纵径（纵轴方向）、横径（平行子叶且与纵轴垂直方向）和侧径（垂直子叶方向）[22]。

1.2.4.2 种子千粒重测定 参照《林木种子检验规程》[23]进行种子千粒重测定。从2021年5月所采“美赐”种子和普通种子中按检验规程要求，各随机选取3份1000粒种子，进行称重。

1.2.4.3 种子发芽率测定 从同期所采“美赐”种子和普通种子里，分别随机选取相同数量的正常种子，使用无菌、透气、柔软的双圈定性滤纸浸湿作发芽床，将种子按2 mm间隔排列在滤纸上，置透明玻璃培养皿中，观测记录发芽情况。种子发芽率计算公式如下：

其中，n为发芽种子总粒数，N为试验种子总粒数。

1.2.4.4 1年生苗期生长性状与皮刺观测 2021年9～11月，对株高、冠幅、地径、皮刺、分枝高等性状在所建立的苗期观测选择群体中进行特性观察测量。使用钢卷尺测量种苗株高、冠幅、分枝高，使用电子游标卡尺测量种苗地径。从皮刺在茎秆上的分布数量、密度及起点终点位置等观测植株皮刺生长特性，从分枝数、分枝级数和分枝起点等观测种苗分枝特性。

1.2.5 优株选择 2021年12月，在“美赐”1年生苗群体中，以植株皮刺数少为选择目标，制定选优标准，进行优株选择，以皮刺性状遗传力预期值为0.60（无性繁殖时预期重复力为0.90），计算选择差、选择强度、选择响应和遗传增益等遗传育种参数。并对初选优株进行详细调查，综合评价各优株特性。计算各遗传参数。参考《林木遗传学基础》[24]和《森林遗传学》[25]，公式如下：

式中x为入选群体平均值，μ为群体平均值，σp为标准差，h2为预期遗传力（无性繁殖时为预期重复力）。

优株入选率的计算公式如下：

其中y为入选优株数，Y为总株数估计值。

1.3 数据处理及分析

借助Excel 2018、SPSS 22.0、Origin29.0等软件统计处理数据和做图，进行显著性检验，计算平均值、标准差、相关系数及育种参数等。

2 结果与分析

2.1 种子特性分析

2.1.1 种子正常率与种子千粒重分析 从表1可知，“美赐”种子正常率平均值为82.80%，而普通种子正常率平均值为70.00%。独立样本t检验显示，“美赐”种子正常率与普通种子存在显著性差异（p=0.013），表明“美赐”种子正常率显著高于普通种子。

表1 “美赐”种子与普通种子特性比较

从表1可知，“美赐”种子千粒重平均值为1.00 g，普通种子千粒重平均值为1.29 g，表明美赐种子千粒重小于普通种子；两者的标准差都较小，美赐种子千粒重标准差是0.05 g，普通种子为0.03 g，表明两者的种子千粒重在个体间差异并不显著。

2.1.2 种子外观形态及种子个体间形态差异比较 种子外观形态及种子个体间形态差异观测结果，见表2。

表2 “美赐”种子与普通种子外观性状比较

由表2可知，“美赐”种子外观形态比普通种子略小。“美赐”种子纵径、横径、侧径平均值为2.092，1.270，0.834 mm，普通种子的纵径、横径、侧径平均值为2.265，1.492，0.981 mm，美赐种子纵径、横径、侧径分别比普通种子小7.51%，14.88%，14.98%，这与“2.1.1”节中种子千粒重的研究结果一致。

从种子外观形态个体间的差异看，“美赐”种子的个体间变异比普通种子大。“美赐”种子的纵径、横径和侧径3个外观性状值的方差（0.017，0.031，0.012 mm2）、标准差（0.133，0.181，0.110 mm）和变异系数（6.36%，14.25%，13.19% ）均明显大于普通种子的相应外观性状值的方差（0.005，0.004，0.012 mm2）、标准差（0.074，0.069，0.115 mm）和变异系数（3.26%，4.62%，11.72%），尤其是“美赐”种子的横径变异更大，最大值/最小值为1.77（1.70/0.96），变异系数达14.25%，普通种子的横径变异较小，最大值/最小值为1.17（1.60/1.37），变异系数仅为4.62%。反映出“美赐”种子的个体间分化比普通种子更大。

2.2 种子发芽特性及发芽率分析

利用2021年5月所采的“美赐”种子和普通种子进行发芽试验，结果见图2。由图2可知，在9月至翌年1月的秋冬季节，“美赐”种子和普通种子经过长达近半年的发芽过程中，前3个月的发芽率都极低，表明此阶段掌叶覆盆子种子休眠特性仍未完全解除，不易发芽。100 d后，无论“美赐”种子还是普通种子的发芽率均开始明显上升，但“美赐”种子发芽率更高。曼-惠特尼U检验结果（p=0.000）显示，“美赐”种子和普通种子的发芽率存在显著差异，试验结束时观测，“美赐”发芽率达14.48%，而普通种子的发芽率仅4.21%。“美赐”种子发芽率高于普通种子，这个结果与上述“2.1.1”种子正常率的研究结果一致。

图2 “美赐”种子与普通种子秋冬季发芽率比较

2021年春，利用2020年5月所采集的“美赐”种子进行发芽试验观测，其结果如图3所示。试验处理种子320粒最终发芽种子数为193粒，发芽率为60.31%，开始发芽时间为第26天。4月5日的发芽种子数最多，为39粒，4月9日、4月15日的发芽种子数最少，均仅4粒，这可能与气温的明显升降变化有关。结合图2“美赐”种子秋冬季经过150 d发芽率才达到14.48%，显示种子采收贮藏后的翌年春季是“美赐”种子的较合适发芽时期。除了“美赐”种子是否已解除休眠因素外，光照、温度等因素可能都是它不同季节发芽率差异的重要原因。

图3 “美赐”种子春季发芽情况

2.3 “美赐”1年生苗期特性分析

2.3.1 “美赐”1年生苗生长性状及相关性 在“美赐”1年生苗的秋季生长的时期Ⅰ（9月9日）、时期Ⅱ（10月14日），对株高、冠幅和地径形态指标分别进行了观测，并分析了生长性状间的相关性，结果见表3。

表3 “美赐”1年生苗株高、冠幅和地径生长变化及性状间相关性

从表3可知，在时期Ⅰ测定时，“美赐”苗的株高、冠幅、地径平均值分别为33.65 cm、21.48 cm、2.45 mm，到时期Ⅱ测定时，“美赐”苗的株高、冠幅、地径平均值分别为47.34 cm、41.10 cm、3.69 mm，时期Ⅱ“美赐”苗的株高、冠幅、地径平均值分别比时期Ⅰ增加40.68%，91.34%，50.61%，表明在秋季这个阶段，“美赐”1年生苗随着温度变凉适宜生长，形态建成较为快速。同时，随着个体形态建成，群体内的个体分化也变得非常明显，时期Ⅰ的标准差分别为10.22 cm、7.20 cm、0.83 mm，变化为时期Ⅱ的标准差13.68 cm、20.28 cm、1.41 mm，时期Ⅱ“美赐”苗的标准差分别比时期Ⅰ扩大33.86%，181.67%，69.88%，其中以冠幅分化更大，地径分化次之。

“美赐”1年生苗的生长性状株高、冠幅及地径两两之间均存在极显著正相关（表3）。其中株高与冠幅的相关系数为0.851（P＜0.01），相关系数最大。株高与地径的相关系数为0.473（P＜0.01），冠幅与地径的相关系数为0.451（P＜0.01），相关系数中等。

2.3.2 “美赐”1年生苗分枝特征 随着“美赐”1年生苗的生长发育，其植株形态开始发生剧烈变化（表4）。在较短的生长阶段内由单茎分枝变为多基生一级分枝茎并在一级分枝茎秆上再产生二级分枝。

表4 “美赐”1年生苗分枝特性

由表4可知，在1年生苗生长的当年，时期Ⅱ（10月4日）至时期Ⅲ（11月29日）时间段，“美赐”种苗出现分枝的植株比例由40.00%增加到了90.91%，其中，大多为基生一级分枝（即分生枝从近地面长出），植株比例达到87.50%。同时植株个体分枝结构也进一步发生分化，在群体里表现不一，有部分植株出现一级分枝后开始继续出现二级分枝。

由表4可知，在产生分枝的“美赐”1年生种苗群体中一级分枝具1枝的植株占60.00%，具2枝的植株占33.33%，平均一级分枝数为1.47枝。同时该群体中，无二级分枝的植株占66.67%，具二级分枝1枝的植株占6.67%，具2枝的植株占26.67%，平均二级分枝数为0.60枝。表明“美赐”1年生苗的植株基本结构是具1～2个一级分枝，较少二级分枝。

2.3.3 “美赐”苗期皮刺生长特性分析

2.3.3.1 “美赐”苗期皮刺生长的时间变化 “美赐”1年生种苗生长期形态发生快速变化的同时，皮刺生长也有较大变化。在时期Ⅰ（9月9日）、时期Ⅲ（11月29日）两个时间点，对“美赐”种苗的皮刺分布情况进行了观测，结果见表5。

表5 “美赐”1年生苗茎秆皮刺分布变化

由表5可知，在此生长过程中“美赐”种苗群体由少数植株有刺（25.00%）快速生长成为了绝大部分植株有刺（92.32%）。“美赐”无刺植株逐渐变得很少，可能是反映了“美赐”控制皮刺生长性状的基因表达是在幼苗的后期阶段。苗期出现皮刺可能也是“美赐”植株从幼苗转化为成苗的形态上变化特征之一。

同时，随着植株的生长，树高增加，植株上皮刺分布的最低位置也发生一定改变。由表5可知，随着“美赐”植株1年生后期生长，基部离地面向上出现第1枚刺的位置有上移趋势，平均分布高度由15.13 cm变为18.77 cm。原因可能是由于植株生长的径向拉伸导致植株整体伸长所引起的，如竹子、杨树等都有类似情况[26]。

2.3.3.2 “美赐”苗期皮刺数量分布特性与密度分布特征

“美赐”1年生苗期皮刺数量分布与密度分布测定结果，见表6。

表6 “美赐”1年生苗皮刺分布特性

从表6可知，“美赐”植株基部出现第1枚刺的平均高度为18.77 cm，茎秆上端出现最后1枚刺的高度平均为65.91 cm。皮刺分布的高低位置个体间差异较大，尤其是茎秆上端分布位置（标准差为16.95 cm）比基部分布位置（标准差为12.51 cm）波动更大。

同时，“美赐”植株上的皮刺分布密度不是均匀的，在植株离地面0～60 cm高度内集中分布了95.24%的皮刺量。而在分生枝茎秆上的各段分布也不均匀。如图4所示，在距离分枝起点10 cm以下茎段皮刺分布较少，平均只有0.92枚；在10～20 cm、20～30 cm、30～40 cm的皮刺分布平均值分别为3.75，4.33，2.17枚；在超过距离分枝起点60 cm以上部分，皮刺分布数量很少，分布平均值仅0.67枚。

图4 “美赐”1年生苗距离分枝起点不同高度茎秆上的皮刺数量

2.4 皮刺性状的优株选择

对“美赐”1年生苗群体进行皮刺数量分布进行测定，植株个体平均皮刺数量值μ为24.80枚，个体间分化变异大，标准差σp为14.51枚，以X=μ-σp为入选标准，确定皮刺性状入选标准为数量≤10.29枚，植株皮刺数量少于此值为候选少（无）刺优株，综合其他性状比较，最后确定5个优株，记为优-1、优-2、优-3、优-4、优-5，最终优株入选率为6.41%，各育种参数如表7所示。通过选择，在有性繁殖情况下选择可得理论遗传增益∆g1为57.10%，在无性繁殖情况下，通过选择可得理论遗传增益∆g2为85.65%，皮刺性状改良效果将极为明显。

表7 “美赐”1年生苗期皮刺性状选择的育种参数

5个优株详细特征如下：

2.4.1 优-1 皮刺数2，分布于距分枝点20～25 cm，向外着生；茎秆数2，绿；叶数17，绿，大小中等，掌状；无病虫害。

2.4.2 优-2 皮刺无；茎秆数2，茎1：绿色（夹杂少许紫），茎2：上端绿，基部紫；叶数26，绿，小，掌状；无病虫害。

2.4.3 优-3 皮刺无；茎秆数2，绿（少部分紫）；叶数24，绿，小，掌状；无病虫害。

2.4.4 优-4 皮刺无；茎秆数2，茎1：绿（少许紫），茎2：紫（少部分绿）；叶数11，绿，小，掌状；无病虫害。

2.4.5 优-5 皮刺数4，分布于距分枝点14～25 cm，向外着生；茎秆数1，绿；叶数12，绿，小，掌状；无病虫害。

3 讨论与结论

本次试验中，测定的“美赐”种子千粒重为1.00 g，较普通掌叶覆盆子种子（1.29 g）轻，两者之间存在显著性差异。刘宇等[27]在研究种子千粒重方面发现，多倍体家系种子千粒重普遍较重，其平均值较普通二倍体家系重22.42%；同时多倍体植物由于染色体组增加，器官往往变大，花期延后，而“美赐”萌芽、开花均早于普通掌叶覆盆子。由于“美赐”是普通掌叶覆盆子中出现的变异类型，这是否可能表明“美赐”是由于发生了遗传变异而遗传物质质量变小有待后续试验验证。

本试验发现，“美赐”1年生苗群体一级分枝数多为1枝，二级分枝数多为0枝。潘彬荣等[21]也发现掌叶覆盆子一般当年抽发新枝，不具二级分枝，第2年抽发二级分枝。王硕等[28]认为植物激素、遗传因子对植株形态调控起主要作用，植物激素独脚金内酯会影响植株分枝数。胡盼盼等[29]探究独脚金内酯对草莓新茎分枝的调控机制时发现，草莓品种“红颜”在定植60 d后进入分枝盛期、分枝数平均值为2.5枝，认为独脚金内酯含量降低促进草莓分枝，在分枝盛期新茎中积累了较多独脚金内酯而抑制了分枝数。美赐种苗分枝数目较少可能也是由于其体内积累较多的独脚金内酯，而抑制其分枝数目增加。这有待后续试验证实，同时也为美赐植株形态调控研究提供了思路借鉴。

试验中发现“美赐”1年生苗群体中无刺植株占比为3.80%，这与代汉萍等[30]在树莓无刺性状杂交试验中“无刺红”与“费尔图德”杂交后代出现无刺实生苗比率2.5%相近。此外，朱报著等[31]研究美丽异木棉子代苗木皮刺时，以多皮刺的WY05为母本、少皮刺的XS22无性系为父本，发现子代有无刺植株6株，占6.67%。这些研究结果进一步表明，植株的皮刺性状存在丰富的遗传多样性，掌叶覆盆子无刺型新品种选育可以通过更多的杂交组合试验，在杂交子代群体中进一步选择优株来实现。

通过本试验观测“美赐”种子特性、发芽特性、苗期特性和苗期皮刺选择，可得到如下结论：“美赐”种子正常率较高，种子形态纵径、横径、侧径和种子千粒重均小于普通种，两者有显著性差异。在相同的发芽环境条件下，“美赐”种子发芽率高于普通种，两者发芽特性差异明显。“美赐”1年生种苗生长性状株高、冠幅、地径之间均存在极显著的正相关关系。“美赐”1年生种苗植株皮刺分布主要集中在0～60 cm高度范围内。“美赐”1年生种苗以基生一级分枝植株为主，一级分枝起点基本接近地面。对“美赐”1年生苗皮刺性状进行优株再选择，理论遗传增益在有性繁殖情况下达57.10%，在无性繁殖情况下可达85.65%，植株少刺改良效果明显，“美赐”品种优良特性可取得进一步提升，使更多更优的新品种选育获得丰富的育种材料和育种前景。