常冠坤 王继丰 于爽 郝婧玮

文章编号：1003?6180（2023） 03?0041?07

摘  要：探讨威灵仙-白花蛇舌草药对治疗癌症的作用机制.从HERB与Swiss ADME两个数据库中筛选出威灵仙-白花蛇舌草药对中活性成分、作用靶点、癌症疾病靶点、活性成分与疾病的共同靶点，筛选出重要的活性成分与关键靶点，将活性成分与关键靶点进行分子对接验证.关键靶点为ESR1，重要活性成分为槲皮素、阿魏酸和恩贝林，这三种药物的活性成分均与疾病靶点蛋白有着较好的结合性.威灵仙-白花蛇舌草药对可能对治疗癌症疾病起着重要作用.

关键词：网络药理学；威灵仙；药对；癌症；分子对接

[   中图分类号    ]S[    文献标志码   ]  A

Mechanism of Couplet Medicines of Clematis chinensis Osbeck

and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer

CHANG Guankun1，WANG Jifeng2，YU Shuang1，HAO Jingwei1*

（1.College of life science and technology，Mudanjiang Normal College，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China；2.Institute of  Nature Resources And Ecology.Has，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin，

Heilongjiang 150040，China）

Abstract：Exploring the Mechanism of couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa Treatment for Cancer.The HERB and Swiss ADME databases were used to screen active ingredients， target proteins， and common targets of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa for cancer treatment， and important active ingredients and key targets were identified and verified through molecular docking.The key target is ESR1， and the important active ingredients are Quercetin， Ferulic acid， and Embelin.All three active ingredients have good binding properties with the disease target protein.Couplet medicines of Clematis chinensis Osbeck and Hedyotis diffusa may play an important role in the treatment of cancer.

Key words：network pharmacology；Clematis chinensis Osbeck；Hedyotis diffusa;couplet medicines；cancer；molecular docking

癌癥是由于生物体某个基因发生突变导致的[1-2]，中草药如威灵仙（Clematis chinensis Osbeck），常与其他中药配伍治疗疾病；白花蛇舌草（Hedyotis diffusa）是南方较为常见的中草药，有着消炎、解毒、抗癌肿等多种药理作用，具有较好的使用价值.[1-4]本文以威灵仙-白花蛇舌草为药对，采用活性成分筛选法[5]，通过网络药理学与分子对接实验，探讨威灵仙-白花蛇舌草药对的抗癌机制.

1 材料与方法

威灵仙-白花蛇舌草对活性成分的收集和筛选 在数据库本草组鉴（http：//drug.ac.cn/，HERB）中分别搜索威灵仙、白花蛇舌草的成分，选择OB score ≥ 30为筛选条件，分选出主要成分.在 Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch/）中，以药代动力学里的胃肠道吸收（GI absorption）为“High”的结果，及类药性（Druglikeness）五个预测（Lipinski，Ghose，Veber，Egan，Muegge）的结果中有2个及以上是“Yes”为筛选条件，对HERB中收集的活性成分进行筛选，筛选得到最终的活性成分.

威灵仙-白花蛇舌草药对活性成分靶点的收集 将得到的活性成分在数据库PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中收集对应的Canonical SMILES，并在SwissTargetPrediction（http：//www.swiss-target-prediction.ch/）输入各个活性成分的Canonical SMILES，物种属性设置为“Homo sapiens”，选择Probability > 0的靶点数据.

癌症靶点的收集 在GeneCards（https：//www.genecards.org/）搜索关键词“cancer”，选择Score ≥ 20 的靶点；在OMIM（https：//www.omim.org/）里的Gene Map中搜索“cancer”，并收集该数据库与癌症疾病有关的所有作用靶点.

疾病与药物共同关键靶点的筛选 将药物活性成分对应的靶点与疾病的靶点上传至Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），取得威灵仙-白花蛇舌草药对与癌症作用的靶点，即共同靶点，并作韦恩图.

药物-成分-靶点-疾病的互作网络构建 采用软件Cytoscape 3.9.0 将药物、成分、靶点、疾病构建成网络图，探究各个成分与各个靶点的相互关系.筛选出威灵仙-白花蛇舌草药对中的药物活性成分.

PPI蛋白互作网络构建 将药物与疾病的共同靶点上传至STRING（https：//cn.string-db.org/）数据库中进行搜索，物种属性选择“Homo sapiens”，余下参数皆为默认值，将得到的相应数据导入Cytoscape 3.9.0 ，得到药对活性成分与疾病的蛋白质（PPI）互相作用网络图.利用该软件中的Network Analyzer对网络图进行拓扑分析，以degree值为主要参考标准作图，使用MCODE模块软件分析网络图中的基因簇，运用cytoHubba模块软件以MCC为参考标准分析核心基因.

对关键靶点进行GO富集分析和KEGG通路的富集分析 将药物与疾病的共同靶点上传至Metascape（https：//metascape.org/），进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析该靶点集参与细胞组成、生物过程、分子功能的作用和种类，分析参与作用的信号通路类型，分析数据上传至在线作图平台微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/），作气泡图.

重要活性成分与主要靶点的分子对接 在PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库中选取主要作用靶点蛋白的pdb格式文件，在TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据中选取重要药物活性成分的mol2格式文件，用AutoDock-Vinna 软件进行分子对接，用Pymol 软件进行可视化分析.

2 实验结果

筛选结果表明，威灵仙的活性成分28个，白虎蛇舌草的活性成分7个，有2个共同成分：白头翁素（Anemonin），槲皮素（Quercetin）.

药物靶点的筛选结果表明，威灵仙活性成分所对应的靶点467个，白花蛇舌草活性成分对应的靶点264个，两者合并去重，总共得到靶点523个.

靶点筛选得到400个靶点，癌症疾病靶点498个，合并去重后得到781个疾病靶点.运用Venny 2.1取药物与疾病的交集靶点，得到交集靶点56个.

运用Cytoscape 3.9.0软件将威灵仙的28个活性成分和白花蛇舌草的7个活性，与56个药物和疾病的共同靶点进行网络互作.网络由92个节点和244条边组成，用Network Analyzer分析各个活性成分的Outdegree值.共同成分槲皮素（B1）的Outdegree值为18.威灵仙活性成分中最大Outdegree值为9，是恩贝林（WLX09）；白花蛇舌草活性成分中最大Outdegree值为14，是阿魏酸（BHSSC03）.

2.1 PPI蛋白互作网络构建

将药物与疾病的共同靶点上传至STRING数据库，将得到的数据导入Cytoscape 3.9.0软件，得到药物与疾病的共同靶点蛋白互作（PPI）网络图，其degree值从里到外逐渐变小，靶点蛋白ESR1的degree值最大为45.以degree值为参考标准，选取数值最大的前八个基因靶点，运用MCODE模块软件分析该网络，得到2个基因簇（表2）.运用cytoHubba模块软件以MCC为参考标准进行分析.前十的基因靶点为EGFR，CCND1，VEGFA，HRAS，STAT3，MAPK1，SRC，MDM2，AKT1，ESR1.

2.2 GO富集分析和KEGG通路的富集分析

将药物与疾病的56个共同靶点上传至Metascape数据库进行GO富集分析和KEGG通路的富集分析.GO富集分析包括分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）.共同靶点集涉及分子功能条目78条，主要关于磷酸转移酶活性、激酶活性、蛋白激酶活性；共同靶点集涉及细胞组分条目44条，主要关于受体复合体、微膜结构域、膜筏；共同靶点集涉及生物过程条目100 2条，主要关于酶联受体蛋白信号通路、腺体的发育、生殖系统发育、生殖结构发育、细胞对化学应激的响应.取GO富集分析3个部分，根据P值前五个条目在微生信平台作气泡图（图1）.

KEGG通路的富集分析涉及152个条目，主要关于癌症通路、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的微小RNA、化学致癌-受体的激活、前列腺癌，还有PI3K-Akt这条重要信号通路.根据P值选取KEGG通路的富集分析结果前20个条目，在微生信平台作气泡图（图2）.

2.3 分子对接验证

选取槲皮素、阿魏酸和恩贝林这三个药物活性成分别与靶点蛋白ESR1进行分子对接.运用AutoDock-Vinna对接，用Pymol分析结果显示.槲皮素与ESR1蛋白进行分子对接，形成1个氢键，结合能为-7.7 kcal/mol（图3）；阿魏酸与ESR1蛋白进行分子对接，形成1个氢键，结合能为-6.0 kcal/mol（图4）；恩贝林与ESR1蛋白进行分子对接，形成3个氢键，结合能为-7.0 kcal/mol（图5）.以上三个活性成分与靶点蛋白皆有较好的结合性.

3 讨论

筛选出药对中的槲皮素、阿魏酸和恩贝林三个重要活性成分，通过对筛选出的共同靶点集进行PPI蛋白互作，ESR1是最重要的靶点.将该靶点与筛选出的三个药物活性成分进行分子对接，发现三个活性成分与ESR1靶点蛋白都具有较好的结合性.对共同靶点集进行KEGG通路富集分析，結果显示多集中于癌症通路.

在蛋白质互作网络中，结合三种筛选方式，得到前五核心靶点分别是ESR1，CCND1，EGFR，STAT3，HRAS.乳腺癌发病后，ESR1会发生突变，是乳腺癌的标志产物[6]，有部分患者的ESR1会发生甲基化，而ESR1未发生甲基化的患者的存活率比发生甲基化的患者存活率要高[7]；ESR1甲基化后也会影响卵巢癌的发生，说明ESR1与多种疾病有着很大的关联性.[8]鉴于ESR1的关联性较多，猜测该基因与其他癌症疾病的发病原因存在较大的关系.

槲皮素、阿魏酸、恩贝林这三种活性成分与疾病靶点的关联度最大，具有更大的研究价值.分子对接显示，这三种活性成分与ESR1靶点蛋白都有较好的结合性.槲皮素对多种癌症均有不俗的治疗效果.如Wang发现槲皮素通过转录因子EB和活性氧依赖性铁凋亡的溶酶体活化诱导p53非依赖性癌细胞死亡[9]，能够调节ROS稳态，抑制Akt和NF-KB途径，使前列腺癌细胞凋亡和坏死.[10]除了直接作用于癌细胞，槲皮素还可以通过改变癌细胞的耐药性.Lu等发现，槲皮素通过通过雄激素受体和PI3K-Akt信号通路，降低了前列腺癌细胞对多西紫杉醇的耐药性.[11]有学者发现，阿魏酸处理宫颈癌细胞系的细胞后，分别能达到88.3%和85.4%的抑制率，且随着阿魏酸处理浓度的增加，宫颈癌细胞周期中的G0期 或 G1期都能发生显著性停滞，也会降低相关蛋白的自噬.[12]在对肺癌的治疗中，阿魏酸衍生物中的FXS-3能对ERK/p38，AKT/mTOR和MEK/ERK信号通路进行负调控，阻止信号的传递，进而使肺癌细胞的增殖与转移受到了抑制，能有效达到治疗肺癌的目的[13]，而另一种衍生物4-乙烯基愈创木酚治疗结肠癌是通过诱导细胞的凋亡达到治疗作用的.[14]恩贝林能改变人体乳腺细胞癌焦点的基因表达，主要体现于细胞增殖的抑制和诱导细胞的凋亡这两方面.[15]恩贝林能抑制Akt信号的传导，能使活化的GSK-3β部分促进前列腺癌细胞的凋亡.[16]在治疗胰腺癌的作用中，恩贝林除了能抑制Akt和Shh通路使胰腺癌细胞的生长受阻，还可以调节肿瘤免疫微环境抑制炎症.[17]目前尚未见有槲皮素、阿魏酸、恩贝林这三种活性成分对靶蛋白ESR1作用的研究报道，基于三种活性成分现有的研究，猜测ESR1可能是这三种活性成分潜在的作用靶点.

对靶点集的富集分析发现，PI3K-AKT信号通路的P值最大，猜想该通路是治疗癌症重要的信号通路. Ma等发现PHLDA2的下调通过PI3K-AKT信号通路抑制结肠癌的EMT并促进自噬.[18]Wang等发现LINC01559通过上调PGK1，诱导PTEN启动子的甲基化，使PTEN受到抑制，进而激活PI3K-AKT信号通路，促进胃癌细胞的增殖.[19]Wang等发现黄芪素能在治疗胃癌过程中首先诱导凋亡信号蛋白的表达，通过抑制PI3K/AKT信号通路，进而抑制癌细胞的扩散，达到治疗胃癌的作用.[20]胡椒碱在治疗胃癌的过程中，同样通过抑制PI3K/Akt信号通路来抑制增殖并诱导人胃癌细胞凋亡，其中涉及到了上调Bax，Bad的蛋白表达和下调Bcl-2，Bcl-xl的蛋白表达.[21]激活或抑制PI3K-AKT信号通路会引起相关癌症发病或诱导癌细胞凋亡，猜想PI3K-AKT信号通路是药对治疗癌症的主要通路.

综上所述，药对的活性成分可能通过调节PI3K-AKT信号通路作用于癌症疾病的靶点，达到治疗癌症的目的.

参考文献

[1]杨淼，乔婵，史美葳，等.烟草eIF4E-1-L的基因组编辑[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2016（04）：50-53.

[2]王詝.脉胞菌hH3v基因的初步研究及原核表达载体构建[J].牡丹江师范学院学报：自然科学版，2009（04）：23-25.

[3]徐坤元，苟筱雯，刘文科.威灵仙的临床应用及其用量探究[J].长春中医药大学学报，2020，36（05）：875-877.

[4]卢灿辉，卢永兵.草药白花蛇舌草的临床应用[J].光明中医，2010，25（07）：1296.

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