徐璐，金俊豪，王怡，金璐璐，徐华健，余振宇，宋传奎，刘英男，肖亚庆

（安徽农业大学茶与食品科技学院，茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥 230036）

我国作为传统的产茶大国，茶叶在生产与消费中所产生的副产物——茶渣产量非常大，每年仅生产茶饮料产生的茶渣就高达18～20 万t[1]。茶渣富含纤维素、半纤维素、木质素、缩合丹宁等功能成分[2]，它们均具有羧基、芳香羧基、酚羟基和氧基等多种官能团，具有很高的开发利用价值。纤维素（C6H10O5）作为天然高分子化合物，具有较高的聚合度，是由葡萄糖单体通过β-（1，4）糖苷键聚合而成的长链线性多糖，约占茶渣总质量的50%[3]。纳米纤维素是纳米级（≤100 nm）的纤维素材料，其优良的机械强度、生物相容性、可再生性使其成为新型绿色复合材料领域极具吸引力的结构强化剂[4]。近年来，开发以天然高分子（如蛋白、多糖、脂质及其混合物）作为成膜基材的绿色、可食性食品包装材料已经逐渐成为研究热点。其中，大豆分离蛋白因其价格低廉、成膜性能好、营养价值高等优势备受青睐[5-6]。然而，纯大豆分离蛋白膜存在阻隔性弱、稳定性差、易溶于水等不足[7]，严重限制了其在食品包装领域的实际应用。提高大豆分离蛋白膜的包装性能成为食品包装领域亟待解决的技术难题，与纳晶纤维素的共混改性是提高蛋白基膜性能的有效手段[8]。然而，以茶渣为原料制备茶渣纳晶纤维素（tea residue nanocrystalline cellulose，TRNC），并与大豆分离蛋白共混成膜的相关研究尚未见报道。基于此，本研究从废弃茶渣中提取分离纳晶纤维素，并对其微观形貌、晶体结构和化学官能团等理化性质进行表征。同时，以大豆分离蛋白为成膜基底，以TRNC 为结构增强剂，开发TRNC-大豆分离蛋白复合膜，并对复合膜的机械性能、阻隔性能、耐水性能进行分析，以期为功能性蛋白基可食用包装膜的设计和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶渣：安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室提供；透析袋（8 000～14 000 Da）：北京索莱宝生物科技有限公司；大豆分离蛋白（蛋白含量大于90%）：上海源叶生物科技有限公司；甘油（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；NaOH、NaClO2、H2SO4（均为分析纯）：国药化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电热鼓风干燥箱（GZX-9070）：上海博迅实业有限公司；高速多功能粉碎机（ST-512）：瑞安市赛特机电有限公司；恒温水浴搅拌器（DF-101S）：巩义市予华仪器有限责任公司；电子天平（ML-3002T/02）：梅特勒-托利多国际有限公司；多头磁力加热搅拌器（HJ-6A）：常州市国华电器有限公司；水浴恒温振荡器（SHY-2A）：常州普天仪器制造有限公司；超声波多频清洗机（KQ-250DE）：昆山超声仪器有限公司；超低温冰箱（DW-86L500）：澳柯玛股份有限公司；冷冻干燥机（CTFD-10S）：青岛永合创信电子科技有限公司；高速冷冻离心机（JW-3021HR）：安徽嘉文仪器装备有限公司；恒温恒湿培养箱（YKHWS-160L）：合肥右科仪器设备有限公司；扫描电子显微镜（S-3700）：日本日立公司；透射电子显微镜（JEM-1230）：日本电子株式会社公司；纳米激光粒度仪（ZEN 3600）：英国马尔文仪器有限公司；傅里叶变换红外光谱仪（Vertex 70）、X-射线衍射仪（D8 Advance）：德国布鲁克公司；热重分析仪（DTG-60A）：日本岛津公司；电子数字卡尺（DL91150）：宁波得力集团有限公司；万能拉伸机（XLW）：济南兰光测试仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶渣纳晶纤维素的制备

茶渣用沸水浸泡1 h 后倒掉茶水，重复3 次，用去离子水反复冲洗，除去水溶性色素等成分。在60 ℃烘箱中干燥24 h，粉碎后过40 目筛。所得茶渣粉在室温（25 ℃）下用乙醇洗涤12 h，去除脂质成分，自然晾干。随后，将所得样品按1∶20（g/mL）料液比浸泡于5.0%NaOH 溶液中，70 ℃条件下搅拌4 h。经大量去离子水清洗后，将不溶性残渣混入2.0%NaClO2溶液中（用醋酸将pH 值调为3～4），70 ℃条件下搅拌2 h，此漂白过程重复5 次。最终，将得到的白色悬浊液用去离子水彻底清洗至pH 值为中性左右，用滤布过滤，得到茶渣纤维素。将茶渣纤维素按1∶20（g/mL）料液比分散于64%的H2SO4溶液中[9]，在45 ℃条件下搅拌90 min。用10 倍冷去离子水稀释酸液以终止水解反应，得到茶渣纳晶纤维素悬浮液，冷冻干燥后得到茶渣纳晶纤维素粉末，备用。

1.3.2 茶渣纳晶纤维素的表征

1.3.2.1 形貌特征表征

取适量冻干后的茶渣粉和茶渣纤维素粉末样品，均匀平铺粘附在导电胶上，使其固定于载物铜板，样品表面进行喷金处理。使用扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）在10 kV 加速电压下观察样品的微观形态[10]。

将大约5 μL 稀释后的茶渣纳晶纤维素悬液滴在普通碳支持膜（230 目）表面，室温25 ℃下过夜自然晾干。用透射电子显微镜在80 kV 下观察纳晶纤维素的微观形貌。从透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）图片中随机选择超过100 个纳米颗粒，使用Nano Measurer 软件统计纳晶纤维素的长度和直径，并计算长径比。

1.3.2.2 Zeta 电位测定

以水为分散剂，使用纳米激光粒度仪在室温25 ℃下测定茶渣纳晶纤维素悬液的Zeta 电位值。

1.3.2.3 化学官能团测定

茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素样品化学官能团的变化情况使用傅里叶变换红外光谱仪进行测量。采用溴化钾压片法，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，进行32 次扫描，扫描数据排除水分与CO2干扰。

1.3.2.4 晶体结构测定

茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素样品的结晶特性使用配备Cu Kα 辐射源（λ=0.154 nm）的X-射线衍射仪进行分析测量。扫描速率为4°/min，扫描范围为5°～90°（2θ）。按照公式计算结晶度（X，%）[11]。

X=（I002-Iam）/I002×100

式中：I002为2θ=22°附近（002）晶格衍射峰的最高强度；Iam为2θ=18°附近的非晶态部分衍射峰的最低强度。

1.3.2.5 热稳定性测定

使用热重分析仪测定茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素样品的热稳定性，结果表示为失重比（%）和失重速率（%/min）。将约5 mg 的干样品在氮气环境下（50 mL/min）做热失重测试，以10 ℃/min 的速率从20 ℃加热到600 ℃。

1.3.3 茶渣纳晶纤维素-大豆分离蛋白复合膜的制备

将一定量的大豆分离蛋白粉末（6%）分别与不同添加量的茶渣纳晶纤维素（0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%）混入去离子水中，10 000 r/min 的速度均质处理5 min，室温25 ℃下搅拌2 h。用2 mol/L 的NaOH 将溶液pH 值调为9.0。所得混合液在85 ℃水浴中加热20 min，然后使用超声波清洗机（25 ℃，500 W）脱气10 min。将成膜溶液倒入直径90 mm 的一次性培养皿中，放进55 ℃的烘箱中12 h[12]，随后移入恒温恒湿培养箱（25 ℃，50%）中平衡48 h 后进行性能测定。

1.3.4 复合膜的性能测定

1.3.4.1 厚度测定

薄膜厚度的测试方法参照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片厚度测定机械测量法》进行。用电子数字卡尺接触测量薄膜，每个试样至少随机测量9 个点，计算求得平均值记为薄膜厚度。

1.3.4.2 机械性能测试

共混膜的机械性能采用万能拉伸机进行测试，记录膜的拉伸强度和断裂伸长率。将对照膜、茶渣纤维素共混膜和茶渣纳晶纤维素共混膜裁剪成长条形（100 mm×15 mm），测试条件为拉伸速度150 mm/min，共持间距50 mm。为保证数据的准确性，每组膜重复6 次，求得平均值。

1.3.4.3 水溶性测定

采用称重法测量共混膜的水溶性，将干燥器中干燥至恒重的对照膜、茶渣纤维素共混膜、茶渣纳晶纤维素共混膜裁剪成正方形（20 mm×20 mm）[13]，称取此时的质量为初始质量。在室温25 ℃条件下，将初始3 组膜试样放入100 mL 的蒸馏水中浸泡12 h，结束后将共混膜试样放入鼓风干燥箱中，在40 ℃的温度下进行干燥，直至恒重后称取测量。根据浸泡前后共混膜的质量变化计算共混膜的水溶性（X，%）[14]。

X=（m1-m2）/m1×100

式中：m1为共混膜浸泡前初始质量，g；m2为共混膜浸泡后的质量，g。

1.3.4.4 水蒸气透过率测定

水蒸气透过率测试参照ASTM E96-95《材料水蒸气渗透性标准试验方法》方法执行。在测试杯（45 mm深度，20 mm 内径）装入10 mL 去离子水，用膜样品（直径30 mm）密封杯口，贮藏在恒定环境（25 ℃，50%）中48 h。每隔6 h 称量杯子的质量。水蒸气透过率[X，10-10g/（m·s·Pa）]计算公式如下[15]。

X=（Δm×L）/（Δt×A×Δp）

式中：Δm/Δt 为失重与时间的曲线斜率，g/s；L 为膜厚度，m；A 为膜覆盖区域的瓶口面积，m2；Δp 为贮藏环境中膜两侧的水蒸气压差，Pa。

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1.4 数据统计分析

使用Statistix 8.0 软件中的单向方差分析法（ANOVA）和Tukeys 检验法在P＜0.05 水平上对数据进行统计分析。试验至少重复3 次，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的宏观形貌分析

图1～图4 描述了各处理阶段茶渣样品的宏观形貌。

图1 茶渣的宏观形貌Fig.1 The macroscopic morphology of tea residue

由图1～图4 可知，冲泡后的茶渣叶底匀整，色泽明亮均一（图1）；经烘干、粉碎、过筛后得到茶渣粉末，其粒度变小、比表面积变大，色泽变暗，这可能是烘干过程中多酚类物质的氧化引起的（图2）；经碱处理、漂白处理后，茶渣粉由褐色转为明显的白色（图3），明显的颜色变化是由于茶渣粉纯化过程中半纤维素、木质素以及其他非纤维素成分（色素、果胶等）的广泛去除。

图2 茶渣粉的宏观形貌Fig.2 The macroscopic morphology of tea residue powder

图3 茶渣纤维素的宏观形貌Fig.3 The macroscopic morphology of tea residue cellulose

图4 茶渣纳晶纤维素的宏观形貌Fig.4 The macroscopic morphology of TRNC

如图4 所示，经硫酸水解制备得到了较为均一稳定的TRNC 胶体悬浮液。静置过夜后，TRNC 悬液并未出现分层或沉淀现象，说明纤维素纳米化处理后，其在水中的分散稳定性得到了改善。

2.2 茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的微观形貌

茶渣粉末、茶渣纤维素和TRNC 的微观结构使用扫描和透射电子显微镜进行观察，结果见图5～图7。

图5 茶渣粉的扫描电镜图Fig.5 SEM image of tea residue powder

由图5 所知，茶渣粉末呈现不规则的团聚形态，可能是由于茶渣粗体粉碎不彻底，粉体间静电排斥力较小，容易发生团聚。纯化步骤包括碱处理和漂白，NaOH 去除了大部分半纤维素，NaClO2漂白去除了木质素以及残留的半纤维素，所得茶渣纤维素呈束状结构（图6），茶渣纤维素周围分散的一些球体物可能是残留的淀粉颗粒。碱处理步骤有助于促进纤维素分子的充分溶胀，而漂白导致了纤维素的部分除颤和纤维束的逐渐打开，从而形成了直径减少的纤维素网络结构。纳晶纤维素的物理尺寸通常在几十纳米到几百纳米之间[16]。茶渣粉末经硫酸水解和机械作用分离得到TRNC，TRNC 呈典型的针状或棒状结构，并伴有少量团聚体出现（图7）。纳晶纤维素较小的物理尺寸和较大的比表面积有助于其通过氢键或范德华力彼此堆叠，从而引发聚集[17]。

图6 茶渣纤维素的扫描电镜图Fig.6 SEM image of tea residue cellulose

图7 茶渣纳晶纤维素的透射电镜图Fig.7 TEM image of TRNC

2.3 茶渣纳晶纤维素的尺寸分布

图8～图10 分别为透射电镜图像中TRNC 的长度（L）、直径（D）和长径比分布直方图。

图8 茶渣纳晶纤维素的长度分布直方图Fig.8 Distribution histogram of TRNC length

图9 茶渣纳晶纤维素的直径分布直方图Fig.9 Distribution histogram of TRNC diameter

图10 茶渣纳晶纤维素的长径比分布直方图Fig.10 Distribution histogram of TRNC length-diameter ratio

纳晶纤维素是原纤维中的结晶区片段，结晶度较高[18]。纤维素来源广泛，结晶区片段的长度、直径等尺寸因纤维素原料来源不同而有所差异。TRNC 平均长度为（795.61±189.27）nm，平均直径为（32.17±11.64）nm，平均长径比为（33.33±15.32）nm。纳晶纤维素具有高长径比的优点[19]，其长径比是决定其性能的重要参数，直接影响到纳晶纤维素的界面吸附能力。一般来说，长径比越高，纳晶纤维素的界面吸附能力就越大，更倾向于在连续相中组装形成网络结构，增强效果也就越好。因此，茶渣纳晶纤维素较高的长径比预示其较强的结构强化性能[20]。

2.4 茶渣纤维素的Zeta 电位

Zeta 电位是表征胶体体系分散稳定性和聚集状态的重要指标。分子或分散粒子越小，Zeta 电位的绝对值（正或负）越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta 电位（正或负）越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。茶渣纳晶纤维素的Zeta 电位见图11。

图11 茶渣纳晶纤维素的Zeta 电位Fig.11 Zeta potential of TRNC

2.5 化学官能团

红外光谱广泛应用于分子结构和物质化学组成的研究，它主要是利用特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构。茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的红外光谱曲线见图12。

图12 茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的红外光谱曲线Fig.12 Infrared spectroscopy curves of tea residue powder，tea residue cellulose and TRNC

如图12 所示，茶渣粉、茶渣纤维素和TRNC 红外图谱的峰位置和峰形大致相同，说明在碱处理、漂白、酸处理过程前后官能团可能未发生显著变化。其中，3 410 cm-1附近的吸收峰可能是纤维素中—OH 伸缩振动，3 000～2 800 cm-1范围内的吸收峰可能与—CH伸缩振动有关，1 730 cm-1处吸收峰为纤维素C O 伸缩振动，1 640 cm-1对应于O—H 弯曲振动[23]。在茶渣纤维素和纳晶纤维素样品中，1 520 cm-1（芳香族骨架振动）和1 250 cm-1（ C—O—C 轴向不对称应变）附近特征峰缺失，可能与半纤维素和木质素成分的去除有关[24]。而纤维素结构对应的特征峰，如1 325 cm-1（O—H 弯曲）、1 152 cm-1（C—O—C 糖苷键不对称拉伸）、1 100 cm-1（C—OH 拉伸）和1 053 cm-1（C—O—C吡糖环振动）在纯化后更加剧烈，这主要归因于纤维素成分的充分溶胀暴露[25]。

2.6 结晶特性

茶渣粉、茶渣纤维素、TRNC 的X 射线衍射曲线如图13 所示。

图13 茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的X 射线衍射曲线Fig.13 X-ray diffraction curves of tea residue powder，tea residue cellulose and TRNC

X-射线在晶体中的衍射现象是晶体中各原子散射波之间的干涉结果，衍射峰与晶体结构有关[26]，衍射强度与定量分析有关。由图13 可知，在21.6°、22.9°、22.7°处出现强特征峰，对应着纤维素晶体中的（002）晶面，16.2°处的特征峰对应纤维素晶体中的（110）晶面，这些特征峰代表着典型的Ⅰ型纤维素结构。TRNC 在34.7°处观察到新的衍射峰，对应于（004）晶面，预示着晶体结构的增强。TRNC 结晶度可达62.36%，明显高于茶渣纤维素（42.67%）和茶渣粉（14.15%）。经纯化和酸解处理，大量无定形区被破坏，结晶区不断被释放，引起结晶度的增强。较高的结晶度有助于强化复合材料的内部结构，并能有效降低气体和水分子的渗透性。

2.7 热特性

热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）是在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，常被用来研究蛋白质基材料的热稳定性。对茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素进行热特性分析，结果见图14～图15。

图14 茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的TGA 曲线Fig.14 The TGA curve of tea residue powder，tea residue cellulose and TRNC

图15 茶渣粉、茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素的DTG 曲线Fig.15 The DTG curve of tea residue powder，tea residue cellulose and TRNC

由图14 可知，样品热失重经历3 个阶段：干燥预热、主失重区间、残留物热解。第一个失重平台在150 ℃左右，与水分等低沸物质的蒸发有关。在200～350 ℃的主失重区间，纤维素缓慢通过受热解聚，内部发生结构重组以及“玻璃化转变”[27]。第三阶段，热解残留物质量下降幅度减缓，TGA 曲线逐渐趋于平缓。TRNC 的热解残留物最少，原因可能是纳晶纤维素的比表面积大，有利于气化反应。由图15 可知，TRNC 的最大降解温度（317.09 ℃）明显高于原料茶渣粉（256.18 ℃），说明与纤维素成分相比，被去除的半纤维素和木质素的热稳定性较差。然而，TRNC 的降解温度低于纤维素（336.19 ℃）。一方面，TRNC 的比表面积高于纤维素，从而导致其更多地暴露在热环境中；另一方面，TRNC表面引入的硫酸盐基团可能会进一步降低纳晶纤维素的热降解活化能。

2.8 大豆分离蛋白基膜的机械性能

图16～图18 显示了对照膜、茶渣纤维素-大豆分离蛋白共混膜、TRNC-大豆分离蛋白共混膜的厚度、拉伸强度和断裂伸长率。

图16 大豆分离蛋白基膜的厚度Fig.16 Thickness of soybean protein isolate based film

图17 大豆分离蛋白基膜的拉伸强度Fig.17 Tensile strength of soybean protein isolate based film

图18 大豆分离蛋白基膜的断裂伸长率Fig.18 Elongation at break of soybean protein isolate based film

由图16～图18 可知，3 组膜的厚度均在80 μm 左右，各组之间不存在显著性差异（p＞0.05），表明茶渣纤维素和茶渣纳晶纤维素在成膜基质中分散均匀、相容性较好。TRNC-大豆分离蛋白共混膜的拉伸强度显著高于对照组（p＜0.05），但茶渣纤维素膜与对照组之间无统计学意义上的差异性（p＞0.05），这是由于茶渣纳晶纤维素的比表面积大，在膜形成的过程中，纤维素与蛋白分子之间发生了一定程度的交联和相互作用[28]。然而，两组复合膜的断裂伸长率较对照组有所下降，尤其是经茶渣纳晶纤维素强化的复合膜（p＜0.05），这是因为水解有效暴露出茶渣中的大量羟基官能团，这些羟基与蛋白质形成更加紧密的氢键，从而降低了膜分子的流动性。另外，未交联的增强剂物理保留在膜网络内部，进一步导致膜的延展性降低。这些相互作用的发生缩小了分子间距离，复合膜形成相对稳定的网络结构，其柔韧性下降，从而降低了断裂伸长率。结果表明制备的TRNC-大豆分离蛋白共混膜机械强度高、柔韧性低，具有强大的抵抗形变能力。

2.9 大豆分离蛋白基膜的水蒸气透过率和水溶性

食品中的水分是影响其贮藏时间和质量的重要物质，阻水性能良好的食品包装袋可防止水分流失，从而起到保护食品的作用。水蒸气透过率反映包装膜材料对水分子的阻隔性能，水蒸气透过率越低，表明水蒸气阻隔性能越好。大豆分离蛋白基膜的水蒸气透过率及水溶性见图19～图20。

图19 大豆分离蛋白基膜的水蒸气透过率Fig.19 Water vapor permeability of soybean protein isolate based film

图20 大豆分离蛋白基膜的水溶性Fig.20 Water solubility of soybean protein isolate based film

由图19 可知，两组复合膜的水蒸气透过率低于对照膜，表明纤维素和纳晶纤维素的加入有效提高了大豆分离蛋白基膜对水蒸气的阻隔性能。其中TRNC 强化膜的水蒸气阻隔性能最好，这可能是由于在该复合膜内部形成了更加曲折的路径，从而阻碍了渗透水分子通过薄膜。

水溶性是评价大豆分离蛋白基膜亲水性能的重要指标。由图20 可知，对照膜与纤维素强化膜的水溶性均大于30%，且两组差异不显著（p＞0.05）。纳晶纤维素强化膜的水溶性约为25%，与其他两组相比显著降低（p＜0.05），表明耐水性能的显著改善。TRNC-大豆分离蛋白共混膜耐水性的提升，可能是由于纳晶纤维素与蛋白质之间发生缔合与交联作用，形成了致密、稳定、有序的网络结构，阻碍了水分子的渗透。另一方面，高结晶度的TRNC 可能作为疏水屏障，阻止水分子进入蛋白膜内部。

3 结论

本研究从废弃物茶渣中提取分离得到茶渣纳晶纤维素，其平均长度约为795.61 nm，平均直径约为32.17 nm，平均长径比约为33.33，呈典型的针状结构。茶渣纳晶纤维素的Zeta 电位值为（-32.76±2.11）mV，具有良好的水分散稳定性；结晶度为62.36%，显著高于茶渣纤维素的42.67%。然而，茶渣纳晶纤维素的热稳定性较纤维素有所下降，这归因于比表面积的增大和硫酸盐基团的引入。茶渣纳晶纤维素能显著改善大豆分离蛋白基膜的拉升强度、降低断裂伸长率，并提高复合膜的水蒸气阻隔性能和耐水性能，表明其有望应用于蛋白基可食性膜的开发。