卿恩华,唐彬铖,牛 添,王珺琦,陈朝颜,胡继伟,何 桦,李 亮,王继文*,胡深强*

(1.四川农业大学 “畜禽遗传资源发掘与创新利用”四川省重点实验室,成都 611130;2.四川农业大学动物遗传育种研究所,农业农村部畜禽生物组学重点实验室,成都 611130)

研究表明,所有鸟类繁殖都通过体内受精完成,但仅有约3%雄鸟保留了外生殖器,在家禽上仅包括鸭和鹅,外生殖器发育状况如尺寸大小、结构特征等与公禽交配行为和授精能力密切相关。公鹅生殖系统由双侧睾丸、附睾和输精管以及一个外生殖器构成[1]。一般认为,公鹅配种能力主要取决于外生殖器和睾丸发育状况与精液品质,其中外生殖器正常发育是自然交配发生的前提条件,而睾丸正常发育是精子发生的基础。与同为家禽的鸡、鸭等相比,公鹅繁殖性能较差,主要体现为公鹅繁殖具有明显的季节性和择偶性,出现外生殖器发育异常、性欲不振、无精、弱精等繁殖障碍比例高,且自然交配下种蛋受精率和孵化率均较低,这成为制约鹅产业发展的瓶颈因素[2-3]。

近些年,在畜禽种业振兴、食品安全、环保压力等新形势下,我国水禽产业正逐步从传统水边粗放散养向现代规模化集约化旱地养殖模式转型升级,为适应新的养殖方式及满足现代育种和生产要求,鹅的交配方式也将从自然交配向人工授精转变,因此提高旱地养殖模式下公鹅的繁殖性能已成为当前鹅育种和生产者的主要目标之一[4]。研究表明,公禽的生殖器官发育受到日龄[5-7]、营养[8-11]、气候[12-16](如光照、温湿度等)、饲养方式等多因素的影响,其中饲养方式是重要的影响因素。前人研究发现,饲养方式转变对公鸡、公鸭繁殖性能均有显著影响。例如,Du等[17]研究结果表明,相较于笼养,放养条件下公鸡的精液量和精子活率更高;Shaheen等[18]研究结果表明,与地面平养条件下自然交配模式相比,笼养人工授精模式下的公鸡繁殖性能损耗较低且繁殖效率更高;Etuk等[19]研究结果表明,饲养方式对番鸭精液品质如精子浓度、精子活率等有显著影响;赵小玲等[20]分析了单笼和本交笼对肉鸡睾丸发育和生殖激素含量的影响,发现本交笼混养的公鸡睾丸重量和曲精小管面积均显著大于单笼饲养。Alam等[21]有关肉鸡的研究结果表明,与地面饲养相比,笼养能提高肉鸡的产蛋量、生育能力、孵化率,并降低死亡率。Zhang等[22]对巢湖鸭的研究表明,网上养殖的鸭脂肪含量更高,血清中胆固醇含量更低,健康状态更好。ukaszewicz等[23]研究结果表明,与半放牧方式相比,放牧条件下公鹅血清睾酮含量及精液品质更优。鹅的旱养方式主要包括地面平养、网上平养、地面网上混合平养、笼养等;相较于地面饲养,网上平养和笼养均实现了粪污分离,且更有利于养殖环境控制和日常饲养管理,显著提高了生产效率[24-26]。然而,目前有关饲养方式尤其是笼养和混合平养对公鹅繁殖性能影响的研究报道还不多见。鉴于此,本研究以繁殖性能优秀的四川白鹅公鹅为试验对象,通过比较分析笼养和网上地面混合平养对鹅睾丸及外生殖器形态学、组织学的影响,旨在为旱养条件下公鹅适宜的饲养方式选择及提高公鹅繁殖性能提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

本研究所用的100只四川白鹅公鹅均由四川农业大学水禽育种场(雅安,四川)提供,用于饲养试验鹅的圈舍、笼具、料槽等设施设备在饲养前都进行了彻底的清洗和消毒。所有试验鹅只均来自同批孵化的种蛋,并在相同的环境条件下进行育雏和上笼饲养,具体饲养管理制度为:第0～28日龄进行室内网上育雏,第29～120日龄进行室内网上地面混合平养,于第120日龄时挑选60只精神状态良好、健康和体重相近的公鹅等分为2组(每组30只),分别进行笼养和网上地面混合平养,两组均饲喂相同的饲料,具体饲料成分及含量列于表1;其中,笼养采用单笼饲养,单笼尺寸为长(0.55 m)×宽(0.37 m)×高(0.7 m);混合平养圈舍尺寸为长(13 m)×宽(6 m),由60 m2的网上平养区域和18 m2的地面平养区域构成。当饲养至270日龄(体成熟阶段)时,对所有试验鹅禁食12 h后,从各组随机挑选16只活体测定其体重及外生殖器相关形态学指标,然后进行屠宰并测定宰后睾丸和外生殖器相关形态学指标,最后从各组采集8只鹅的左侧睾丸和外生殖器用于组织学分析。

表1 饲料成分及含量Table 1 The feed ingredients and contents

1.2 形态学指标测定

禁食结束后,首先测定活体重量,然后对公鹅进行翻肛,使其外生殖器完全露出,记录外生殖器螺旋数后,使用游标卡尺测量其基部直径、自然长度和拉直长度。其中,基部直径指鹅外生殖器基部的横向长度;自然长度指鹅外生殖器完全露出后,其顶部至基部的长度;拉直长度指使用外力将鹅外生殖器拉至最长时,其顶部到基部的长度。将鹅颈静脉放血处死后,迅速开膛取出双侧睾丸和外生殖器,使用电子天平测定左、右和双侧睾丸重量以及外生殖器重量,并使用游标卡尺测量各侧睾丸的长径、短径和背腹径;其中,长径指睾丸腹侧纵向长度,短径指睾丸腹侧横向长度,背腹径指睾丸背侧至腹侧的长度。睾丸和外生殖器的器官指数计算公示如下:睾丸器官指数=睾丸重量(g)/活体重量(g);外生殖器器官指数=外生殖器重量(g)/活体重量(g)。

1.3 组织学指标测定

首先将新鲜采集的鹅左侧睾丸及外生殖器组织固定于4%多聚甲醛24 h以上,接着取出组织在通风橱内用手术刀将切片部位修剪平整,然后将修剪好的组织放于脱水盒内,并采用不同浓度酒精、醇苯、二甲苯和蜡进行梯度脱水与浸蜡,最后置于切片机上进行切片,单张切片厚度约4～6 μm,每只鹅的睾丸和外生殖器组织均至少制作3张切片。将制作好的石蜡切片烘干、脱蜡后,采用苏木精和伊红进行H&E染色,随后将染色后的鹅睾丸和外生殖器切片置于显微镜(BX53,OLYMPUS,美国)下观察和拍照。每张切片至少选取3个不同视野进行组织学指标测量,采用 Image-Pro Plus 6.0软件对每个视野内睾丸(曲径细管直径、实质面积、间质面积、生精上皮厚度等)或外生殖器(角化上皮厚度、外层胶原蛋白厚度、内层胶原蛋白厚度、淋巴管腔直径等)组织学指标进行测量,并对睾丸切片视野中曲精细管、支持细胞、间质细胞、精原细胞、生殖细胞等进行计数。实质间质比计算公示如下:实质间质比=实质面积/间质面积。

1.4 数据统计分析

所有试验结果均以“平均值±标准差”的形式表示。应用SAS 9.4软件对鹅生殖器官形态学和组织学数据进行统计分析,采用单因素方差分析(ANOVA)比较两组之间是否存在统计学差异,采用Pearson系数分析不同指标之间的相关性。P<0.01表示组间差异极显著或不同指标间极显著相关,P<0.05表示组间差异显著或不同指标间显著相关。采用GraphPad Prism 8.0软件用于可视化统计结果分析。

2 结 果

2.1 笼养和混合平养方式下鹅睾丸及外生殖器形态学的比较分析

如图1所示,在睾丸形态学层面,相较于混合平养组,笼养组鹅的左、右侧睾丸尺寸和体积均相对较大。进一步统计分析发现,笼养组鹅左侧、右侧和双侧睾丸重量均极显著高于混合平养组(P<0.01),且笼养组鹅左侧、右侧和双侧睾丸器官指数均极显著高于混合平养组(P<0.01);与此同时,笼养组鹅右侧睾丸长径以及左侧、右侧睾丸短径均显著高于混合平养(P<0.05),但两组之间左侧睾丸长径、背腹径以及右侧睾丸背腹径差异不显著(P>0.05)。

a. 笼养组代表公鹅的睾丸照片。R1～R3分别为各组代表个体1～3,L代表左侧睾丸,R代表右侧睾丸,下同。b. 混合平养组代表公鹅的睾丸照片。c. 睾丸重量。d. 睾丸器官指数。e. 睾丸形态学指标。“*”表示两组间差异显著(P<0.05),“**”表示差异极显著(P<0.01),下同a. The pictures of testes from representative male geese in CRS. R1-R3 represent individual 1-3. L represents the left testis, while R represents the right testis. Below is the same. b. The pictures of testes of male geese in MRS. c. The testicular weight. d. The testicular organ index. e. The testicular morphological parameters. "*" indicates a significant difference between the two groups (P<0.05), while "**" indicates an extremely significant difference between the two groups (P<0.01). Below is the same图1 笼养和混合平养组鹅睾丸的形态学差异Fig.1 Morphological difference of the geese testis between the CRS and MRS groups

如图2所示,在外生殖器形态学层面,相较于混合平养组,笼养组鹅的外生殖器尺寸相对较大、螺旋结构更明显。统计学分析结果显示,笼养组鹅外生殖器的自然长度和基部直径显著高于混合平养组(P<0.05),拉直长度极显著高于混合平养组(P<0.01),但两组之间鹅外生殖器重量及其器官指数和螺旋数差异不显著(P>0.05)。

a. 笼养组代表公鹅的外生殖器照片;b. 混合平养组代表公鹅的外生殖器照片;c. 外生殖器重量;d. 外生殖器器官指数;e. 外生殖器螺旋数;f. 外生殖器形态学指标a. The pictures of the external genitalia from representative male geese in CRS; b. The pictures of the external genitalia from representative male geese in MRS; c. The external genital weight; d. The external genital organ index; e. The external genital helical number; f. The morphological parameters of the external genitalia图2 笼养和混合平养组鹅外生殖器的形态学差异Fig.2 Morphological difference of the geese external genitalia between the CRS and MRS groups

2.2 笼养和混合平养方式下鹅睾丸及外生殖器组织学的比较分析

如图3所示,在睾丸组织学层面,从两种饲养方式下鹅睾丸切片中均能观察到相似的曲精细管、生精上皮、间质细胞、支持细胞、精原细胞等组织学构成,但两组之间部分组织学结构在数量和直径上存在差异。统计学分析结果显示,笼养组鹅睾丸精原细胞数量显著高于混合平养组(P<0.05),睾丸实质间质比、生精上皮厚度、支持细胞数量和生殖细胞数量均极显著高于混合平养组(P<0.01),且笼养组鹅睾丸间质细胞密度和曲精细管数量极显著低于混合平养组(P<0.01),但笼养组与混合平养组鹅睾丸曲精细管直径之间差异不显著(P>0.05)。

如图4所示,在外生殖器组织学层面,从两种饲养方式下鹅外生殖器切片中均能观察到角化上皮、外层胶原蛋白、内层胶原蛋白和淋巴管腔等组织学构成,但两组之间部分组织学结构在厚度上存在差异。统计学分析结果显示,笼养组鹅外生殖器的角化上皮厚度显著低于混合平养组(P<0.05),但两组之间外生殖器的外层胶原蛋白厚度、内层胶原蛋白厚度和淋巴管腔直径差异均不显著(P>0.05)。

a. 笼养组鹅外生殖器组织学结构.b. 混合平养组鹅外生殖器组织学结构。Ke. 角化上皮;Oc. 外层胶原蛋白;Ce. 内层胶原蛋白;Ll. 淋巴管腔。c. 外生殖器组织学指标a. Histological structure of the geese external genitalia in CRS. b. Histological structure of the geese external genitalia in MRS. Ke. Keratinized epithelium; Oc. Outer collagen; Ce. Inner collagen; Ll. Lymphatic lumen. c. The external genital histological parameters图4 笼养和混合平养组鹅外生殖器的组织学差异Fig.4 Histological difference of the goose external genitalia between the CRS and MRS groups

2.3 鹅睾丸和外生殖器形态学与组织学指标的相关性分析

本研究进一步对两种饲养方式下鹅睾丸、外生殖器的组织形态学指标进行了相关性分析。睾丸指标之间的相关性分析结果如图5a所示,鹅睾丸重量、长径、短径及其器官指数均与生精上皮厚度、曲精细管直径、生殖细胞数量呈显著(P<0.05)或极显著正相关(P<0.01),与曲精细管个数呈极显著负相关(P<0.01);睾丸长径、短径及其器官指数与实质间质比呈显著正相关(P<0.05);睾丸重量、长径、短径及其器官指数与间质细胞数量均不显著相关(P>0.05)。

外生殖器指标之间的相关性分析结果如图5b所示,鹅外生殖器内层胶原蛋白厚度与其自然长度、螺旋数均呈极显著正相关(P<0.01);外生殖器重量与其拉直长度、基部直径呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关;外生殖器基部直径与其自然长度、拉直长度、螺旋数均呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关;外生殖器角化上皮厚度、外层胶原蛋白厚度和淋巴管腔直径与其自然长度、拉直长度、基部直径和螺旋数均不显著相关(P>0.05)。

2.4 不同饲养方式下鹅睾丸与外生殖器组织形态学的相关性分析

本研究进一步分别对笼养、混合平养方式下的鹅睾丸与外生殖器组织形态学指标进行了相关性分析。笼养组的相关性分析结果如图6a所示,鹅睾丸重量、器官指数、长径和短径与外生殖器重量和器官指数呈极显著正相关(P<0.01);睾丸器官指数与外生殖器拉直长度呈显著正相关(P<0.05);睾丸实质间质比与外生殖器基部直径呈显著正相关(P<0.05),与外生殖器外层胶原蛋白厚度呈显著负相关(P<0.05);睾丸生精上皮厚度与外生殖器拉直长度和螺旋数呈显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)正相关;睾丸曲精细管数量与外生殖器重量、器官指数、拉直长度和基部直径呈显著负相关(P<0.05);睾丸支持细胞数量与淋巴管腔直径呈显著正相关(P<0.05);睾丸间质细胞数量与外生殖器基部直径呈显著负相关(P<0.05),与外层胶原蛋白厚度呈极显著正相关(P<0.01);睾丸生殖细胞数量与外生殖器重量和器官指数呈极显著正相关(P<0.01)。

图6 笼养组(a)和混合平养组(b)鹅睾丸与外生殖器组织形态学指标的相关性热图Fig.6 Heatmap of the correlation analyses in the histomorphological parameters between the geese testis and external genitalia in CRS (a) and MRS (b) groups, respectively

混合平养组的相关性分析结果如图6b所示,鹅睾丸短径与外生殖器外层胶原蛋白厚度呈显著正相关(P<0.05),与内层胶原蛋白厚度呈显著负相关(P<0.05);睾丸器官指数与外生殖器螺旋数呈显著负相关(P<0.05);睾丸曲精细管直径与外生殖器胶原蛋白内层厚度呈显著负相关(P<0.05);睾丸曲精细管数量与外生殖器重量和淋巴管腔直径呈显著负相关(P<0.05);睾丸精原细胞数量和外生殖器拉直长度呈显著正相关(P<0.05)。

3 讨 论

在当前鹅养殖模式转型升级背景下,提高公鹅的配种能力已成为鹅育种和生产者的主要目标之一。公鹅生殖系统主要由睾丸和外生殖器组成,前者决定其生精能力,后者影响其交配行为。公鹅睾丸和外生殖器发育过程受到品种、营养、光照、温度、饲养方式等因素影响,但目前有关饲养方式尤其是旱养方式对公鹅繁殖性能影响的研究报道十分匮乏。本研究以四川白鹅为试验对象,比较分析了笼养和网上地面混合平养对公鹅睾丸、外生殖器形态学及组织学的影响。在形态学层面的研究结果显示,笼养组鹅睾丸重量、器官指数、长径和短径均显著高于混合平养组,且笼养组鹅外生殖器自然长度、拉直长度和基部直径均显著高于混合平养组,表明不同旱养方式显著影响了鹅睾丸和外生殖器的发育过程,笼养较混合平养更利于公鹅生殖系统的发育。一般认为,雄性鸟类的射精次数、射精量和精子浓度均随睾丸重量的增加而增加[27]。在一些雄性哺乳动物上,外生殖器自然长度更长、基部直径更粗的个体精子密度更大[28]。在鹅上的研究结果显示,自然交配条件下外生殖器螺旋数更多的公鹅授精成功率更高[29]。以上研究结果提示,相较于混合平养,笼养条件下公鹅的精液品质及配种能力可能更好。在组织学层面的研究结果显示,与混合平养组相比,笼养方式下鹅睾丸实质间质比、生精上皮厚度和曲精细管面积更大,且精原细胞、支持细胞和生殖细胞数量更多;笼养方式下鹅外生殖器的角化上皮厚度更薄,表明不同旱养方式显著影响了鹅睾丸和外生殖器的组织学结构。睾丸曲精细管是精子发生的重要场所[30],睾丸间质细胞和支持细胞负责合成并分泌调控生殖系统发育的生殖激素,且睾丸支持细胞还能为精子的生成过程提供稳定的环境[31-32]。外生殖器的角化上皮层起着屏障作用,能够防止内部水分的流失[33-34]。由此推测,笼养组鹅睾丸的组织学结构可能更有利于精子生成,而混合平养组外生殖器的组织学结构可能更有利于抵抗环境中的有害物质。在网上地面混合平养方式下,公鹅群体内会出现采食不均、打架等现象,且不同个体在群体中的社会地位也不同,而单笼饲养方式下则不会出现这些问题且环境卫生条件更好,这可能是造成笼养组鹅睾丸和外生殖器发育更好的主要原因。

为进一步弄清鹅睾丸与外生殖发育之间的关联性以及饲养方式对二者共同发育的影响,本研究对两种饲养方式下鹅睾丸、外生殖器的组织形态学指标之间的相关性以及不同饲养方式鹅睾丸与外生殖器组织形态学指标的相关性进行了分析。结果显示,鹅睾丸重量及其器官指数、睾丸长径或短径与其生精上皮厚度、曲精细管直径、生殖细胞数量和精原细胞数量等显著相关,表明鹅睾丸的形态学与组织学指标之间存在较强的相关性。同时,鹅外生殖器自然长度和螺旋数与其内层胶原蛋白厚度存在显著正相关,而与其他组织学指标相关性不显著,表明胶原蛋白厚度可能是影响鹅外生殖器发育的关键因素之一。研究表明,鹅外生殖器的发育主要受到由睾丸分泌的雄激素的调控[35],推测鹅外生殖器的发育与睾丸发育密切相关。与此推论一致,本研究结果证实了两种饲养方式下鹅睾丸与外生殖器的组织形态学指标之间存在显著相关性。其中,笼养组鹅睾丸重量及其器官指数、睾丸长径或短径、生精上皮厚度、曲精细管数量、支持细胞数量、间质细胞密度、生殖细胞数量与外生殖器重量及其器官指数、外层胶原蛋白厚度、螺旋数、淋巴管腔直径呈显著正或负相关;而混合平养组仅有睾丸长径、短径、曲精细管数量、曲精细管直径、睾丸精原细胞数量与外生殖器拉直长度、螺旋数、外层胶原蛋白、内层胶原蛋白、淋巴管腔直径存在显著相关性。由此可知,两种饲养方式下鹅睾丸与外生殖器的发育过程紧密相关,且笼养组鹅睾丸与外生殖器组织形态学指标之间的相关性更强。李明阳[36]对笼养蛋鸭舍的环境参数进行检测后发现,笼舍上层空间中粉尘和细菌浓度较下层更低、风速更高,且NH3、CO2和水蒸气浓度更低,进而更有利于降低家禽的应激水平,这直接导致上层蛋鸭的健康状况更好、生产性能更高。在笼养条件下,鹅处于较上层的空间位置,其生活环境相较于混合平养条件而言更加稳定,且接触到有害物质的机会更少,促使笼养方式更有利于鹅生殖器官的发育[37-38]。Du等[39]研究发现,在地面平养模式下公鸡会因采食不均对其精液质量造成负面影响。考虑到鹅是具有社会等级划分的动物[14],混合平养方式下存在更多影响公鹅生殖系统发育的因素,如社会等级、应激、抢食、环境卫生等,这些因素造成了笼养组鹅睾丸与外生殖器发育更好且相关性更强。

4 结 论

综上,与网上地面混合平养方式相比,120日龄上笼且持续150 d的单笼饲养方式显著促进了公鹅生殖系统的发育,改善了睾丸生精能力,且笼养组睾丸与外生殖器发育的同步性更好。