张苏其,云金虎,赵圃圃,狄昌毅,魏子秋,张往祥,2*

1(南京林业大学 林学院,南方现代林业协同创新中心,江苏 南京,210037) 2(扬州小苹果园艺有限公司,江苏 扬州,225200)

海棠(Malusspp.)是蔷薇科(Rosaceae)苹果属(MaulsMill.)落叶乔木或灌木,观赏价值高,其花、叶、果都具观赏性[1]。如今,高观赏性海棠品种因育种步伐加快而日益增多,已有千个品种,资源相当丰富[2],然而除了观赏,大部分的植物资源无法得到较好的利用,造成了一定的浪费。相关研究表明,海棠不仅观赏性好,同时也具有良好的食用性[3],明代以前的湖北地区土家族人就有饮用湖北海棠叶茶的历史,湖南和江西一带有饮用林檎茶和花红茶的习惯,因其消暑解渴、抑菌保鲜之效,常在酷夏饮用[3]。海棠叶片活性物质丰富,一些营养学家调查结果显示,苹果多酚是摄取酚类物质的重要来源,而海棠是苹果属植物,其叶片的多酚和黄酮含量显著高于花和果[4],尤其是二氢查尔酮类化合物如根皮苷、三叶苷、根皮素等,更具有减轻痛风和调节尿酸代谢[5]、降血糖[6-7]等功效。海棠叶片还含多种矿质元素、微量元素和维生素[8],保健价值较高,所以使用海棠叶制成茶饮用,对人的身体健康大有裨益。

红茶因其不错的香气滋味,是大多数人喜爱的一种茶类,我国消费量以及出口贸易量年年增长,红茶的市场需求大[9]。茶叶的品质好坏受多种因素影响,由于品种差异和采收时间的不同,其主要物质成分如氨基酸、多酚等有较大差异,影响着茶叶的口感、色泽等[10],选取优良的品种和适宜的采收时间可制作出一款品质较高的茶,但就目前海棠叶茶的研究报道来看,对茶用品种资源筛选的研究不足,不同时期海棠叶茶品质的研究较少,因此有必要对品种和时期进行探究。本试验选取不同时期和品种制成红茶,对其主要成分品质和感官品质分析,旨在选出综合品质较高的品种茶和采摘时期,为海棠茶用品种开发提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所选海棠品种来自江苏省扬州市江都区仙女镇国家海棠种质资源圃,品种名如表1所示。选择树龄为6年生,生长健康的树苗,所采的品种树苗棵数大于100棵,在2021年4月15日、6月1日和8月12日采摘树苗外围枝条嫩梢头,保留一叶,无病虫叶。采摘后立即装进透气纱网袋,带回红茶加工地。以市场购买的宜兴红茶(来自江苏宜兴的黄岭茶场)、正山小种和金骏眉(均来自八马茶业)作为抗氧化活性实验的对照茶样。

红茶的制作:萎凋3～4 h(采用自然萎凋:室内阴凉无风处,摊叶厚度2 cm左右。叶子色泽转暗,含水率在50%～60%左右,叶片萎蔫,叶质由脆变软,叶梗折而不断,基本手握成团不松,青草香气显现)。然后揉捻1 h(轻揉20 min-翻堆-重揉20 min-翻堆-轻揉20 min,叶片表面汁液明显,叶子明显成条),发酵3 h(摊叶厚度10 cm左右,湿度92%～95%,温度25 ℃,每隔1 h翻一遍,使其均匀发酵)后干燥(2次烘干法:120 ℃ 10 min,90 ℃ 15 min)。将制得的海棠红茶冷却后装袋。将海棠红茶分为两部分,一部分供感官评审用,一部分将其放置高速磨粉机,高速磨粉1 min,装进密封袋,放置冰箱冷藏,用于测定主要生化成分。对照红茶的磨碎处理同海棠红茶。每类样品3次重复。

蒽酮、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钠、九水硝酸铝、亚硝酸钠(均为分析纯),国药集团化学试剂有限公司;福林酚(分析纯)、葡萄糖、谷氨酸、单宁酸、绿原酸、芦丁、3-羟基根皮苷、根皮苷、三叶苷、根皮素(均为色谱纯),上海源叶生物科技有限公司;香草醛(分析纯),上海阿拉丁生化科技有限公司;浓硫酸、双氧水、水杨酸、甲醇(均为分析纯),南京化学试剂有限公司;DPPH(分析纯),上海麦克林生化科技有限公司;甲醇、冰醋酸(均为色谱纯),美国TEDIA公司。

1.2 仪器与设备

JK-WB-8A型电热恒温水浴锅,上海精学科学仪器有限公司;JP-100S型洁盟牌超声波清洗机,深圳市洁盟清洗设备有限公司;SPECORD 200PLUS型紫外-可见分光光度计,德国耶拿分析仪器股份公司;Allegra 64R Centrifuge型台式高速离心机,美国BECKMAN COULTER有限公司;219260300273540型电动揉茶机、NL-5888型烘焙机,长沙周眼镜五金机械厂;JY-6CFJ-7B型红茶发酵机,泉州佳友智能茶叶机械厂;Waters 2489高效液相色谱仪,美国沃特世公司;高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 滋味成分的测定

称取海棠红茶粉末0.1 g(精确到0.001 g),加入8 mL蒸馏水,沸水煮45 min,8 000 r/min离心5 min,得到上清液,定容到10 mL容量瓶,待测。游离氨基酸含量测定:参考GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》;可溶性糖含量测定:采用蒽酮-硫酸法,参考《茶叶生物化学实验教程》[11]。

1.3.2 活性成分的测定

称取海棠红茶粉末0.1 g(精确到0.001 g),加入5 mL的70%(体积分数)甲醇,在50 ℃、200 W的功率条件下,超声提取30 min,8 000 r/min离心5 min,合并2次上清液定容至10 mL容量瓶,待测。多酚含量测定:福林酚显色法,参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》;总黄酮含量测定:硝酸铝-亚硝酸钠法,参考李楠等[12]的方法略有改动,将提取液稀释10倍,吸取0.5 mL提取液,用纯乙醇补至5 mL,加0.3 mL的50 g/L亚硝酸钠溶液,加0.3 mL的100 g/L硝酸铝溶液,加4 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液,显色后测定吸光值;原花青素含量测定:香草醛-盐酸法,参考李春阳等[13]的方法;单宁酸含量测定:采用铁氰化钾分光光度法,参考许晓岗等[14]的方法。

1.3.3 酚类组分的测定

使用超高液相色谱法测定6种酚类物质,参考LIU等[15]的方法。酚类提取液制备:称取0.1 g(精确到0.001 g)海棠红茶粉末,加入5 mL的70%甲醇,在50 ℃、200 W功率条件下,超声提取2次,每次60 min,8 000 r/min离心5 min,合并2次提取液,定容至10 mL容量瓶,过0.22 μm滤膜后待检测。标准溶液的配制:分别精密称取标准品根皮苷10 mg,三叶苷5 mg、3-羟基根皮苷10 mg、根皮素5 mg、芦丁10 mg和绿原酸5 mg(均精确到0.000 1 g),于10 mL量瓶中,加入色谱甲醇溶解定容,得到根皮苷、三叶苷、3-羟基根皮苷、根皮素、芦丁和绿原酸的质量浓度分别为1.0、0.5、1.0、0.5、1.0和0.5 mg/mL。绘制标准曲线时再分别稀释成一系列工作液。标准曲线绘制是以标准溶液质量浓度(μg/mL)为横坐标,各酚类物质对应的峰面积为纵坐标。标品出峰图见图1,标品的标准曲线见表2。

图1 六种酚类组分标品出峰图Fig.1 Peak diagram of six phenolic component standards注:标品出峰顺序从左往右依次为绿原酸、3-羟基根皮苷、芦丁、根皮苷、三叶苷和根皮素

表2 酚类组分标准曲线Table 2 standard curves for phenolic components

色谱条件:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5.0 μm);柱温25 ℃,样品温度4 ℃,流动相:A为纯甲醇,B为0.1%(体积分数)的乙酸水溶液,等梯度洗脱,流动相比例为55∶45,流速1 mL/min,检测波长为280 nm,样品进样体积10 μL,检测时间30 min。

1.3.4 抗氧化活性的测定

海棠红茶样品的待测液使用测活性成分的提取液,对照茶样的待测液制备步骤与1.3.2待测液提取步骤相同。DPPH自由基清除率和铁还原力参考朱小芳等[16]的方法;羟自由基清除率参考张亚琨等[17]的方法;亚硝酸盐清除率参考邢佳等[18]的方法。以市场红茶的抗氧化活性为对照。

1.3.5 感官评价

红茶冲泡条件以及评分标准参考GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》。取未磨碎茶叶2 g于白色茶杯中,倒入100 mL沸水泡5 min。挑选共计9名经过培训的评审人员,年龄为20～30岁,无感官能力缺陷,具备一定的感官评价能力,在无杂味、干净、光线柔和明亮的环境条件下对海棠红茶的汤色、香气和滋味进行评审打分,每个样品评价结束后休息10 min。评分标准如表3所示。

表3 海棠红茶感官评分标准Table 3 Crabapple black tea sensory scoring criteria

1.3.6 数据处理

使用Excel进行数据基本统计描述,使用SPSS 26.0进行方差分析及主成分分析(principal component analysis, PCA),使用Origin Pro 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 不同品种和时期海棠红茶滋味成分分析

游离氨基酸在茶叶中主要提供鲜爽滋味,氨基酸含量高的,茶叶品质会比较好,可溶性提供甜味,可缓解茶的苦涩,这两者对茶叶滋味品质影响较大。如图2所示,不同品种和时期海棠红茶的滋味成分存在显著差异(P<0.05)。游离氨基酸含量变化在(44.55±0.73)～(8.64±0.20) mg/g,最高的是6月采制的‘钻石’品种,在均值图中,4月采制的茶的游离氨基酸含量均值含量高最高,‘钻石’品种茶的3个时期游离氨基酸含量均值高于其他品种。可溶性糖含量变化在(18.6±0.42)～(6.66±0.12) mg/g,最高为4月采制的‘钻石’品种茶,所测的3个时期中,6月采制茶的可溶性糖含量均值高于8月,最低是4月。‘钻石’品种茶3个时期的可溶性糖含量均值最高。

a-游离氨基酸含量;b-可溶性糖含量;c-滋味成分均值;d-滋味成分均值图2 不同品种和时期海棠红茶滋味成分含量及均值Fig.2 The content and average content of flavor ingredients of crabapple black tea in different varieties and periods注:不同字母表示不同品种差异显著(P<0.05)(下同)

2.2 不同品种和时期海棠红茶活性成分分析

多酚、黄酮、原花青素和单宁酸具有活性,对人体有特殊的功能作用。多酚具有抗氧化作用[19],黄酮可减缓卵巢早衰及防治骨质疏松[20],原花青素本身是一种天然的抗氧化物质,且具一定的抑菌功效[21],单宁酸也具抗氧化性[22]。如图3所示,不同品种和时期之间的海棠红茶活性成分含量差异显著(P<0.05)。多酚含量为(147.43±0.66)～(49.73±0.73) mg/g,最高的是4月采制的‘钻石’品种,‘钻石’品种茶的3个 时期多酚含量均值高于其他品种,6月的7个品种茶的多酚含量均值高于4月和8月。总黄酮含量为(30.39±1.22)～(8.69±0.51) mg/g,最高的是4月 采制的‘钻石’,‘钻石’品种茶3个时期的总黄酮含量均值高于其他品种茶,4月的7个品种茶的总黄酮含量均值高于6月和8月。原花青素含量为(14.19±0.16)～(4.9±0.08) mg/g,最高的是4月采制的‘钻石’,‘钻石’3个时期的原花青素含量均值高于其他品种,本研究的7个品种茶的原花青素含量均值在8月最高。单宁酸含量为(15.07±0.06)～(4.49±0.07) mg/g,含量最高是6月采制的‘钻石’,‘钻石’品种茶的3个时期单宁酸含量均值均高于其他品种,本研究的7个品种茶的单宁酸含量均值6月最高,其次是4月。

a-多酚含量;b-总黄酮含量;c-原花青素含量图;d-单宁酸含量;e-活性成分均值;f-活性成分均值图3 不同品种和时期海棠红茶活性成分含量及均值Fig.3 The content and average content of active ingredients in crabapple black tea of different varieties and periods

2.3 海棠红茶6种酚类组分分析

二氢查尔酮类化合物包括根皮苷、三叶苷、3-羟基根皮苷、根皮素等物质,因在少数植物中存在,故被称为‘少数黄酮类’,在防治糖尿病,抗肿瘤,预防肥胖等方面有显著成效[23-25]。如表4所示,6种酚类物质含量差异显著(P<0.05),这6种酚类物质之中,根皮苷均值最高,为(33.58±32.24) mg/g,其次是三叶苷、3-羟基根皮苷、芦丁、绿原酸,根皮素含量最低。根皮苷含量最高是6月采制的‘约翰东’,三叶苷含量最高的是4月采制的‘钻石’,3-羟基根皮苷含量最高的是8月采制的‘粉芭蕾’,芦丁含量最高时6月采制的‘亚瑟王’,绿原酸和根皮素含量高是6月采制的‘亚瑟王’和‘天鹅绒柱’。7个品种茶的3-羟基根皮苷、芦丁、根皮苷和根皮素含量均值都是6月最高,分别为(4.85±3.25)、(4.70±4.94)、(41.06±38.22)和(0.24±0.23) mg/g,7个品种茶的三叶苷和绿原酸含量均值是4月较高。

表4 不同品种和时期海棠红茶六种酚类物质含量 单位:mg/g

2.4 不同品种和时期海棠红茶抗氧化能力分析

如图4所示,不同品种和时期海棠红茶抗氧化能力差异显著(P<0.05)。DPPH自由基清除率变化范围是(89.17±0.49)%～(63.59±1.15)%,‘皇家美人’品种茶DPPH自由基清除率均值最高,3个时期均值大小顺序为6月>8月>4月。对照茶宜兴红茶、正山小种和金骏眉的DPPH自由基清除率分别为(83.40±0.27)%、(84.08±0.74)%和(82.59±0.28)%,3个对照茶样均值为83.36%,海棠红茶中DPPH自由基清除率大于对照茶样均值的有10个茶样。羟自由基清除率变化为(40.81±0.53)%～(12.81±0.94)%,‘钻石’品种茶的羟自由基清除率均值最高,3个时期的均值大小顺序为8月>6月>4月。对照茶的羟自由基清除率分别为(25.70±0.50)%、(32.91±0.32)%和(31.28±0.50)%,均值为29.96%,海棠红茶中羟自由基清除率大于对照茶样均值的有9个茶样。铁还原力变化为(1.30±0.04)～(0.87±0.05),‘钻石’品种茶的铁还原力均值最高,3个时期均值大小顺序为6月>8月>4月。对照茶的铁还原力分别为(1.05±0.05)、(1.12±0.03)和(1.21±0.01),均值为1.13,海棠红茶中铁还原力大于对照茶样的有4个茶样。亚硝酸清除率为(59.50±0.13)%～(30.85±0.15)%,‘钻石’品种茶的亚硝酸盐清除率均值最高,3个时期的均值大小顺序为4月>6月>8月。对照红茶的亚硝酸盐清除率分别为(48.92±0.73)%、(49.49±1.33)%和(49.85±0.68)%,均值为49.42%,海棠红茶中亚硝酸盐清除率大于对照茶样均值的有2个茶样。

a-DPPH自由基清除率;b-羟自由基清除率;c-铁还原力;d-亚硝酸盐清除率;e-抗氧化能力均值图;f-抗氧化能力均值图4 不同品种和时期海棠红茶抗氧化能力及均值Fig.4 Antioxidant capacity and average value of crabapple black tea of different varieties and periods注:编号8、9和10为对照红茶:宜兴红茶、正山小种和金骏眉

2.5 不同品种和时期海棠红茶感官分析

感官评价在茶叶品质评价中不可或缺。海棠红茶感官总得分如图5所示,在(87.33±0.58)～(66.33±1.15),所测的7个品种中,感官得分均值排名前三的依次是‘粉芭蕾’、‘约翰东’和‘钻石’,基本特征是汤色红亮,具有一定浓郁香气,口感醇柔。3个时期的感官得分均值分别是81.33、81.28和76.42。4月和6月感官得分近,8月感官得分偏低。

图5 不同品种和时期海棠红茶的感官指标得分Fig.5 Sensory index scores of crabapple black tea of different varieties and periods注:横坐标表示时期-品种,如4-1代表4月品种1

2.6 不同品种和时期海棠红茶主成分分析和评价

将3个时期7个海棠品种红茶的16个指标进行了降维处理,如表5所示,特征值大于1的累计贡献率达到81.374%,基本代表了所有指标信息。故可以用这4个PC代替原来16个指标信息,前3个主成分综合了多酚、黄酮、单宁酸、原花青素、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、亚硝酸盐清除率、铁还原力、根皮苷、3-羟基根皮苷、可溶性糖、根皮素等一些活性物质指标和部分滋味指标,累计贡献达到70.759%,PC4综合了绿原酸、芦丁指标信息,方差贡献率为10.615%。根据主成分分析提取的因子得分,计算4个PC得分和综合得分。如表6所示7个品种的综合得分总分排前三的依次是‘钻石’、‘粉芭蕾’和‘约翰东’,数值为4.848、1.457和0.322,3个时期综合得分总分最高的是4月,为2.727分,其次6月,为2.393分,最低是8月,且4月和6月总得分均是正值,8月为负值。‘钻石’、‘粉芭蕾’和‘约翰东’品种制作的茶品质较好,4月采摘制作品质较好。

表5 各主成分的特征向量、特征值、贡献率和累计贡献率Table 5 Eigenvectors, eigenvalues, contribution rates, and cumulative contribution rates of each principal component

表6 不同品种和时期海棠红茶评价结果Table 6 Evaluation results of crabapple black tea of different varieties and periods

3 结论

不同品种和时期海棠红茶的主要成分含量有显著差异,游离氨基酸含量随着时间延长,游离氨基酸含量显著降低,这与大部分人研究结果一致[26],‘亚瑟王’品种含量最高,可溶性糖含量偏低。多酚含量最高的是4月采制的‘钻石’品种茶,为(147.43±0.66) mg/g,这比刘天庆等[27]研究结果的最高总酚含量高近50 mg/g,可能是品种不同或叶片嫩度差异造成的。总黄酮含量最高的是4月采制的‘钻石’品种茶,为(30.39±1.22) mg/g,7个品种茶的总黄酮含量均值较高的是4月采制的海棠茶,其次是6月。有研究得出5月海棠叶的总黄酮较高[28],本研究的4月茶是15日采摘,时间上较为接近。原花青素含量最高的是‘钻石’品种茶,且在4月最高,本研究中,原花青素含量变化与时期变化不成一致规律,有研究指出原花青素含量累积高低和植物颜色深浅关系密切[29],每个海棠品种不同时期的叶子颜色深浅有所变化,可能是原因之一。海棠红茶单宁酸均值比其他代饮茶低,如比金露梅茶低60～90 mg/g[30],海棠红茶口感可能会更柔和,涩味不明显。根皮苷是海棠的主要酚类成分,一些苹果属植物资源叶片的根皮苷含量可以达到100 mg/g[31],本研究的海棠根皮苷含量高于刘天庆等[27]的研究结果,这可能是品种不同或者加工方式不同所致。抗氧化能力中,‘钻石’的抗氧化能力强,6月采制的茶抗氧化能力较强,在感官评价中,7个品种中,得分均值较高,感官较好的品种有‘粉芭蕾’‘钻石’和‘约翰东’,4月和6月得分相近。

结合内含物质及抗氧化活性指标的PCA结果和感官得分发现有3个品种制作出的茶品质较好,为‘钻石’、‘粉芭蕾’和‘约翰东’品种,4月采摘制作的茶品质最好,其次是6月。

海棠红茶富含活性物质,保健价值高,有望成为一种符合消费需求的新型茶饮。本研究分析了海棠茶的滋味成分、功能物质和抗氧化活性,再结合感官评价,选出了制作茶叶较好的3个品种和叶片采摘期,可以为海棠茶的开发利用提供一定参考依据。本实验采样时期偏少,无法精确确认最好的采摘制作时间,今后还需增加采样时期选择。本实验选择的品种材料只有7个,品种有限,今后还需扩大品种选择,同时本实验的材料仅限扬州市,结论具有地区的局限性,仅能代表扬州地区,未来还需增加不同地区材料的选择。