刘佳豪，雷江英，沈凡钰，何闳翃，陈德纯

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041)

前言

氨气(Ammonia)是集约化养殖场最容易产生的有害气体，它具有强烈的刺激气味. 氨气可以影响鸡的生长繁殖，降低其生产性能；赵福庆[1]通过对某市鸡舍内氨气含量的调查发现，北方冬天氨气含量普遍偏高，且氨气暴露降低了肉鸡新城疫抗体合格率及肉鸡的生产性能.氨气还可以使禽类多器官发生组织损伤及炎症. 安阳[2]通过氨气对鸡脾脏免疫毒性的研究，得到氨气暴露后NF -κB、TNF -α 以及炎症因子NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18 表达增强的结果，证实氨气引发了炎症损伤. 氨气也能引起细胞的凋亡. 徐延敏[3]研究氨气对鸡肝脏损伤的机制发现，鸡长期暴露于高浓度氨气下，其细胞内线粒体凋亡信号通路被激活，引发鸡肝细胞的凋亡. 目前对氨气中毒无有效药物，只能采取给予大量新鲜空气、饮水及对症治疗进行防控与急救.因此，寻找靶向清晰、高效低毒的药物能够为氨气中毒提供一种新的治疗措施.

木犀草素(Luteolin)含有大量挥发油，可以通过水蒸气蒸馏的方法提取，该提取物中主要成分为黄酮，故被称作黄示灵.木犀草素能够抑制细胞的凋亡.郭彦芳等人[4]研究木犀草素抑制NLRP3 信号通路，从而抑制大鼠神经细胞凋亡，证实了木犀草素具有抑制细胞凋亡的作用.木犀草素也具有抑制炎症发生的作用.木犀草素可以通过NF -κB/P53 信号通路缓解汞中毒时大鼠慢性肝损伤和炎症的发生[5].木犀草素还具有抑制NF-κB 蛋白的表达的作用.Baty 等人[6]通过研究木犀草素对铅中毒诱导大鼠皮层损伤的神经保护作用，证明了木犀草素也能抑制NF -κB 蛋白的表达.网络药理学通过搭建“木犀草素-氨气中毒-靶点”的网络关系，从而分析和预测木犀草素治疗氨气中毒的作用位点[7].本研究则基于计算机网络药理学相关大数据以及使用分子对接相关技术，预测出木犀草素对氨气中毒产生保护作用的核心靶点，并分析了木犀草素干预鸡氨气暴露后诱发细胞焦亡的机制，为后续相关试验研究与临床应用提供了相应的参考.

1 实验方法

1.1 木犀草素作用靶点的筛选

对木犀草素作用靶点的获取主要有两条途径:(1)运用TCMSP 数据库，以化合物名检索其相关靶点.(2)使用PubChem 下载化合物结构与分子信息，再将化合物3D 结构SDF 格式导入到PharmMapper 数据库获取相关靶点. 最后将(1)和(2)两种途径预测得到的化合物相关靶点对应到蛋白质序列数据库Uniprot 中进行同一矫正命名并去重.

1.2 疾病相关靶点的收集与筛选

在Genecards 和OMIM 两个数据库输入“Ammonia poisoning”检索词，对疾病的相关作用靶点进行检索，随后对靶点进行整理、去除重复靶点.然后将其与1.1 中所得到的木犀草素相关作用靶点进行匹配，使用Venny2.1 作图软件绘制韦恩图并取其交集.

1.3 “氨气中毒-靶点-木犀草素化合物”网络的构建与分析

将氨气中毒与木犀草素的共同靶点连同木犀草素本体一起上传到Cytoscape 3.8.2 版本的软件中，构建“氨气中毒-靶点-木犀草素化合物”网络图.

1.4 PPI 网络构建及核心靶点分析

对于PPI 网络构建采用两种方式:(1)将1.2 中获得的共同靶点导进数据库STRING 中，并设置好生物的种类(Homo sapiens)，各靶点间互作的最低阈值设置成0.4，去除其中孤立的节点，最终搭建蛋白互作网络图. (2)将各靶点互作的网络关系数据导进Cytoscape 3.8.2 软件系统中，绘制出蛋白互作网络图.PPI 网络图中的节点大小和颜色的深浅程度会随着靶点Degree 值的增加而变大和变深.随后将PPI 网络图上传至Cystoscap 3.8.2 软件中，运用该软件中Network Analyzer 模块进行拓扑分析，最后选取Degree值大于平均值的核心靶点，使用R4.0.5 软件绘制条形图；其次使用Cystoscap3.8.2 版本软件的MCODE模块来对所得靶点进行聚类分析，其目的在于筛选出更加精确的核心靶点.

1.5 GO 和KEGG 信号通路的富集分析

木犀草素和氨气中毒病的共同靶点被放进David数据库完成GO 和KEGG 信号通路的富集分析，并使用R 语言软件系统对富集的结果进行可视化处理，最后绘制出更加直观的条形图和气泡图.

1.6 木犀草素与关键靶点蛋白的分子对接

首先从PubChem 数据库获取木犀草素化合物结构，之后将其导入Chem 3D 软件中，利用该软件中MM2 模块优化木犀草素化合物结构，保存为SDF 格式文件，作为分子对接的配体分子. 再通过在线服务器Swiss-Model 同源建模得到靶蛋白的蛋白结构.随后用Schrödinger Maestro 软件中的Protein Preparation Wizard 模块处理蛋白，并用OPLS3e 对其进行最小化；使用LigPrep 模块对配体进行优化. 然后导入制备好的受体，根据蛋白结构特点预测对接位点. 最后在Glide 模块中通过SP 方法进行分子对接及筛选.

2 结果

2.1 木犀草素和氨中毒病共同靶点

使用TCMSP 数据库检索木犀草素化合物的蛋白靶点，检索共获得54 个蛋白靶点.将从Pubchem 数据库中获取的木犀草素化合物的结构上传到Pharm-Mapper 数据库，预测其作用靶点，从该数据库中共检索到356 个蛋白靶点.将两个数据库获得的靶点进行整理并去除重复靶点，共获得392 个相关靶点. 采用Genecards 数据库和OMIM 数据库，以“Ammonia poisoning”为检索词，分别获得397 个和13 个疾病作用靶点，经整理后最终得到408 个疾病作用靶点. 随后获取各数据共有差异表达基因，得到木犀草素干预氨气暴露后细胞焦亡的潜在作用靶蛋白共62 个(图1)，包括ALB、TP53、CASP3、HSP90AA1、NF - κB、NFκBIA 等.

图1 木犀草素治疗氨气中毒的潜在靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of potential targets of luteolin for the treatment of ammonia poisoning

2.2 化合物-疾病-靶点网络构建及分析

将氨气中毒与木犀草素的共同靶点连同木犀草素本体一起上传到Cytoscape 3.8.2 软件，构建“氨气中毒-靶点-木犀草素化合物”网络图(图2)，由网络图可见，共有70 个节点、136 条边，这说明靶点与疾病、木犀草素都存在着相互作用的关系. 其中图中红色代表氨气中毒疾病，紫色代表木犀草素化合物，蓝色表示蛋白靶点，边表示相互作用关系.

图2 木犀草素化合物-靶点网络Fig.2 Luteolin compound-target network

2.3 PPI 网络构建及核心靶点分析

将1.2 中获得的共同靶点导进数据库STRING，实验中生物的种类选择的是“Homo sapiens”，各靶点间互作的最低阈值选择的是0.4，去除其中孤立的节点，最终搭建形成蛋白互作网络图(图3a)，由图可见ALB、 TP53、 CASP3、 HSP90AA1、 TP53、 CASP3、HSP90AA1、NFκBIA 等处于网络图中心，是较为核心的靶点.为了缩小核心靶点的范围，在Cytoscape 3.8.2软件中对靶点互作关系的数据进行分析，随后绘制出更加清晰的蛋白互作网络图(图3b)，分析结果后共得到62 个节点和552 条边，平均节点度为17.8，其中核 心 靶 点 包 括 ALB、 TP53、 CASP3、 HSP90AA1、NFκBIA 等.从3b 的结果中选取大于平均Degree 值的核心靶点，使用R4.0.5 软件绘制条形图(图3c)，最终得到ALB、TP53、CASP3、HSP90AA1、NFκBIA 等多个核心靶点.其次，考虑到相关靶点间可能存在隐形联系，因此使用Cystoscap 3.8.2 中MCODE 模块进行聚类分析，并对聚类分析结果进行筛选，得到3 个基因簇和包含NFκBIA、TP53、ALB 在内多个核心靶基因(图3d). 综合上述几种方法的结果，最终选取了ALB、TP53、CASP3、HSP90AA1、NF - κB、NFκBIA 六个核心靶点进行后续的分子对接实验.

图3 木犀草素蛋白互作网络图以及核心靶基因Fig 3 protein interaction network and key gene of luteolin

2.4 活性靶点生物学功能与通路

2.4.1 GO 富集分析结果

GO 富集分析的结果包括生物学过程、细胞组分和分子功能.该结果共涉及289 条生物学过程、40 条细胞组分表达过程和74 条分子功能相关的过程，分别选取每部分前10 个通路绘制气泡图和条形图(图4).这些靶点主要涉及药物反应(response to drug)、脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、胞外隙(extracellular)、相同蛋白结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)等生物学功能.

图4 木犀草素治疗氨气中毒潜在靶点GO 富集结果Fig 4 GO analysis of potential targets for luteolin in treating ammonia poisoning

2.4.2 KEGG 通路富集分析结果

木犀草素与氨气中毒疾病共同靶点的KEGG 通路分析是在David 数据库中完成的，结果共涉及138条KEGG 通路，挑选前20 条信号通路绘制成气泡图和条形图(图5).按P值判断其可靠程度，颜色越深表明富集程度越高.核心通路有脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、癌症通路(pathways in cancer)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、白细胞介素-17 信号通路(IL -17 signaling pathway)等.

图5 木犀草素治疗氨气中毒潜在靶点KEGG 富集结果Fig 5 KEGG pathway analysis of potential targets for luteolin in treating ammonia poisoning

2.5 分子对接结果

利用Schrödinger Maestro 软件分别对Luteolin 化合物与ABL、HSP90AA1、CASP3、TP53、NF - κB 和NFκBIA 靶蛋白进行分子对接(图6)，其木犀草素与ABL、HSP90AA1、CASP3、TP53、NF-κB 和NFκBIA 核心靶点的结合能力分别为-6.94、-4.25、-5.11、-3.97、-7.23、 -5.5. 核心靶点与化合物的结合能越低，表明靶蛋白与化合物的亲和力越大. 由分子对接结果可见化合物Luteolin 与NF-κB 靶点蛋白存在较好的结合作用且匹配度高，结合能为-7.23. 在Pymol2.1 版本软件中对木犀草素化合物与NF -κB 蛋白形成的复合物进行可视化处理，以获得木犀草素化合物与NF-κB 蛋白的结合模式.从该结合模式中可以直观看到Luteolin 与NF-κB 蛋白有相互作用的活性氨基酸残基有LYS -155、GLN -156、LEU -153、ARG-102、VAL-103、ARG-192、TYR-196 等.

图6 木犀草素与疾病相关靶点分子对接Fig 6 Molecular docking patterns of luteolin and disease-related targets

3 讨论

木犀草素中含有大量的挥发油，可以通过水蒸气蒸馏的方法提取，该提取物中主要成分为黄酮，具有很好的抗炎和抗氧化效果.沈瑞明等人[8]发现木犀草能够降低IL -1β、IL -17、TNF - α、IL -6 的表达水平，证实了木犀草素有着良好的抗炎功效. 邹国涛等人[9]证实了木犀草素的保护作用与抑制NF -κB 信号通路的活化有关.木犀草素还有干预细胞焦亡的作用.赵毅[10]发现木犀草素能够显著抑制细胞的焦亡.但对于木犀草素干预鸡氨气暴露后细胞焦亡机制的研究很少，使得木犀草素对氨气暴露产生保护机制的核心作用位点以及通路不明确，从而影响木犀草素治疗氨气中毒的临床应用.

网络药理学是一种基于计算机大数据，预测药物临床应用的安全性以及有效性，这在中药研究方面已经成为一种新颖且便捷的方法[11]. 本研究基于计算机网络药理学数据库，构建“木犀草素-氨气中毒-靶点”网络图以及PPI 网络图以预测木犀草素治疗氨气中毒的靶点，其结果显示TP53、CASP3、HSP90AA1、NFκBIA 为主要靶点. 通过对核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析，发现这些靶点主要涉及药物反应(response to drug)、脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、胞外隙(extracellular)、相同蛋白结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)等生物学功能；且主要的通路有pathways in cancer、TNF signaling pathway、IL-17 signaling pathway 及NF -κB signaling pathway. 最后将木犀草素作为配体，ABL、HSP90AA1、CASP3、TP53、NF -κB 和NFκBIA 蛋白作为受体进行分子对接，结果显示木犀草素与NF -κB有较强的结合能力，预测木犀草素可通过NF -κB 靶点发挥干预氨气暴露后细胞焦亡的作用.

Caspase-3 是细胞凋亡过程中主要的一种蛋白酶，它也是CTL 细胞发挥杀伤作用的重要组成部分.Syed Waqas Ali Shah[12]在氨气致肉鸡淋巴器官炎症、自噬和凋亡的机理研究中发现，氨气暴露提高了Caspase-3、Caspase-9、P-53 蛋白的表达.赵福庆[1]通过研究不同氨气浓度下，肉鸡脾脏组织中细胞因子相关基因mRNA 的表达，结果表明高浓度氨气组P -53、Cyt -C、Caspase3、Caspase9 基因的蛋白表达水平远远高于低氨气组和对照组. 多个实验研究证明Caspase3 是氨气暴露后导致宿主炎症反应的主要炎性因子.万蕾[13]对木犀草素抗大鼠离体心脏A/R 损伤的研究中发现，木犀草素能够显著降低Capase3 蛋白起到抗炎的作用. 吴逸[14]对木犀草素抗癌研究，得到的结果为在240 μm Lut 组中，Caspase9、Caspase3 蛋白表达明显受抑制(P＜0.05). 本研究则通过对核心靶点进行GO 和KEGG 富集分析，分析结果显示木犀草素能够通过TNF 信号通路、AGE-RAGE 信号通路等多条通路作用于Caspase3，最终起到抑制炎症的作用.

NF - κB 是一种具有多项转录调节功能的蛋白质，NF-κB 在静息细胞中常常与抑制蛋白IκB 结合形成复合体，当NF -κB 受到外界不良因素刺激后，它则会参与应激反应过程、免疫细胞的活化、增殖、分化及凋亡等.Chang 等[15]研究表明，iNOS 诱导的肺部病变的潜在机制与NF -κB 激活和Th1/Th2 失衡有关；Syed[12]研究氨气暴露后对鸡胸腺中COX -2、iNOS、NF-κB、IL-2、IL-6 基因表达的影响，结果显示这些炎症因子和细胞因子表达增加. 这证实了NF -κB 也是氨气的主要致炎因子.王伟等人[16]通过对木犀草素及其它黄酮类药物的抗炎、抗氧化作用研究，发现木犀草素可以显著抑制Iκκβ、IκBα 的磷酸化，进而较好地抑制NF-κB 信号通路发挥抗炎活性.本研究通过蛋白互作网络，筛选出了NFκBIA 靶点(属于IκB 家族)，并对其GO 和KEGG 富集分析结果显示木犀草素可以通过NF -κB 信号通路、TNF 信号通路等多条通路去调控NFκBIA 靶点，从而影响NFKB 的表达，最终影响机体炎症的发生. 细胞焦亡是氨气中毒时机体的天然免疫反应，且机体能够通过NF - κB、TNF-α 等多种信号转导途径导致NLRP3 炎性小体的产生，继而诱发细胞焦亡[17].Baty 等人[6]通过研究木犀草素对铅中毒诱导大鼠皮层损伤的神经保护作用，证明了木犀草素也能抑制NF -κB 蛋白的表达，起到抗炎的作用. 故本研究又对木犀草素和NF -κB蛋白进行了分子对接，结果显示结合能为-7.23，木犀草素与靶点蛋白存在很好的结合作用且匹配度高，预测结果与文献符合.

综上所述，本研究借助网络药理学工具，发现了木犀草素干预鸡氨气暴露后细胞的焦亡呈现多靶点多途径特点；并利用分子对接方法初步验证了木犀草素与氨气诱发细胞焦亡的关键蛋白具有发生相互作用的分子基础.虽然网络药理学能快速有效的找到药物治疗疾病的作用靶点，但由于数据库的选择与相关资料有限，且仅仅基于计算机网络药理学数据库，因此该研究存在一定的弊端，需进一步用可靠的实验数据加以验证，从而进一步丰富该研究内容.