于海玲，胡宇磊，熊显荣，杨璐瑜，张 贺

(1.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室，四川 成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，四川 成都 610041；3.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041)

随着我国人民生活质量的提高，人们对牛奶的需求也逐渐升高.牦牛奶作为高原农牧民重要的生活原材料，农牧民对奶品质的要求也逐渐增加. 阿坝藏族羌族自治州是我国重要的高原牧区之一，本地区以及周围相邻地区的牦牛存栏量占全国牦牛存栏量三分之一，但本地区仍然存在畜群结构不合理、畜种生产性能低等问题[1].为了提高生产性能，育种人员使用具有优良性状的平原牛与牦牛进行杂交，繁育出杂种一代的犏牛.研究表明，犏牛相对于牦牛具有明显的杂种优势[2]，其泌乳性能显著高于牦牛. 因此高产犏牛选育成为高原牧区畜牧业发展的关键.

乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)是长链脂肪酸合成所需酶之一.ACC 催化乙酰辅酶A(CoA)羧化生成丙二酰辅酶A[3]，然后利用多功能酶-脂肪酸合成酶，将Malonyl-CoA 用于长链脂肪酸的合成，这涉及到棕榈酸合成的七种不同的酶反应.在此反应中起到主要催化作用的是乙酰辅酶A 羧化酶. 该酶由位于牛第19号染色体上的ACACA基因负责编码，在脂肪酸代谢过程中起至关重要的调节作用[4]，其转录由四个启动子PI、PIA、PII 和PIII 调控[5]. 启动子PI(人)和PIA(啮齿动物和反刍动物)负责神经系统和白色脂肪组织中的基因表达. 作为管家基因，启动子PII(哺乳动物)可在所有组织中被转录[6]. 启动子PIII 的转录在人类和反刍动物中检测到，它负责哺乳期间乳腺中的基因表达[7].Moioli B 等人研究发现ACACA基因是影响绵羊奶中脂肪含量的潜在候选基因[8]，Federica Signorelli 通过对ACACA基因启动子III 片段进行测序分析后发现了3 个SNPs 与山羊奶的脂肪含量有关[9]，Hirokazu 等人在日本黑牛和荷斯坦牛ACACA基因的研究中也通过序列比对分析证明了ACACA基因多态性会影响牛奶和牛肉中脂肪酸的组成[10]. 目前国内对ACACA基因多态性与产奶性能的关系已在荷斯坦奶牛和羊上有了前期的研究，但在犏牛上还未见相关报道.脂酰辅酶A 去饱和酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)是内质网酶之一(endoplasmic reticulum，ER)，对通过本身合成或从饮食中提取的饱和脂肪酸生物合成单不饱和脂肪酸(MUFAs)发生催化，该酶由位于牛26 号染色体上的SCD基因编码，显示为SCD1亚型.SCD基因负责在碳链的第9 个和第10 个碳原子之间添加双键[11]，大量证据表明其与奶牛乳脂和乳脂中脂肪酸的合成密切相关[12-14].因此，推测SCD基因可能在犏牛乳脂合成中起一定作用，可作为犏牛的泌乳性状候选基因.

目前已有对牦牛基因SNPs 的部分研究[15-17]，但是犏牛基因多态性的研究还鲜有报道. 鉴于此，本研究对ACACA基因和SCD1 基因上的2 个显著SNPs 位点在犏牛群体中进行验证，使用PCR 结合DNA 测序技术对g.1488 C ＞G 和g.239 A ＞T 位点进行基因型分析与检测，研究其基因多态性及其与犏牛产奶性状的关联性，为进一步开展高产犏牛培育工作提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究样本采集及数据收集于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县. 试验选取了月龄相近，胎次均为2 胎，且均为产犊后三个月左右的母犏牛，共计384头，试验牛饲养环境相同，营养水平和管理方式一致.取样及数据收集时间为2020 年5 ～10 月. 每隔10 d早晚共测定两次样本牛产奶量并进行记录，每个样本取25 mL 奶样，寄送至新希望有限公司洪雅阳平分公司，使用乳成分分析仪对各个样本的乳成分理化指标(DHI)进行分析.在测定产奶量的同时采用颈部静脉采血10 mL，使用抗凝采血管，将其放入4 ℃冰盒内，从红原带回实验室后转入-20 ℃冰箱冻存.

1.2 DNA 提取与检测

使用购自南京诺维赞生物科技股份有限公司的DNA 提取试剂盒(DC111)提取犏牛基因组DNA，将提取后的DNA 样品放入-20 ℃备用. 制备2%的琼脂糖凝胶，按照5 μL DNA 样品、1 μL 的6 ×Loading Buffer 缓冲液的比例充分混匀，吸取混合液加入到琼脂糖凝胶点样孔中. 设置电压为100 V、电泳时间为40 min，电泳完成后将凝胶放入凝胶成像系统中观察条带.

1.3 引物设计及PCR 扩增

根据GenBank 上公布的牦牛ACACA、SCD1 基因序列(GenBank no.NW_005392972.1、GenBank no.NC_037353.1)，使用primer5.0 软件设计引物见表1，并由上海生工生物工程股份有限公司合成.

表1 引物序列信息Table 1 Sequence information of primers

PCR 反应体系25 μL:2 × Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，基因组DNA 2.0 μL；ddH2O 8.5 μL.PCR 扩增程序:95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s；退火温度分别为59 ℃和55 ℃；72 ℃延伸15 s，35 个循环，72 ℃延伸5 min，置于4 ℃保存. 扩增产物使用2%琼脂糖凝胶电泳(120 V，30 min)检测特异性.

1.4 候选基因的多态性位点检测

通过直接测序法对SNP 位点进行检测与基因分型，对PCR 扩增产物进行电泳检测，条带清晰，交由上海生工生物工程公司进行DNA 单向测序. 使用Chromas 软件对测序峰值图进行分析，对基因型进行判定，计数统计，用于后续的试验分析.

1.5 数据统计分析

使用Excel 2019 对试验数据进行统计整理，通过不同基因型频率和等位基因频率计算多态信息含量(PIC)，公式如下:

其中，Pi和Pj分别为第i 与第j 个等位基因在群体中的频率，n为等位基因数.通过SPSS 19.0 软件的一般模型分析基因型对犏牛产奶性状的影响，公式:

其中，Yij为产奶量或乳成分的实际测量值；μ为群体内某一性状均值；Gi为总体效应；Pi为胎次效应；e为随机残差效应. 数值以“平均数±标准差”表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著.

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 检测

采用核酸浓度检测仪对提取的犏牛血液基因组DNA 进行纯度检测，浓度均在100 ng/μL 以上，DNA的OD 值均在1.8 ～1.9 之间，证明DNA 样品纯度合格.使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，无拖尾现象，表示DNA 没有被降解或者含有蛋白质污染，符合试验要求(图1).

图1 DNA 完整性电泳检测Fig.1 DNA integrity detection by electrophoresis M:DL2000 DNA marker 条带 M:DL2000 DNA marker

2.2 PCR 扩增产物检测

通过设置温度梯度优化了ACACA与SCD1 引物的最适退火温度，分别为55 ℃和59 ℃.分别对ACACA和SCD1 在最适退火温度条件下进行PCR 产物扩增.可以得到清晰且单一的目的条带，特异性较好，产物长度分别为345 bp 和465 bp 左右，可用于后续的测序分析(图2).

图2 候选基因的PCR 产物电泳检测Fig.2 PCR product electrophorogram M:DL2000 DNA marker 条带 M:DL2000 DNA marker

2.3 SNPs 的筛选及分型

通过测序对比及分析发现在ACACA扩增片段的第137 bp 处即ACACA基因的5'UTR 调控区域1488 bp处发生了C/G 碱基替换(图3)，显示有两个等位基因(C 和G)，三种基因型(CC、GC、GG). 将该位点命名为g.1488C ＞G.

图3 ACACA 基因g.1488 C ＞G 多态性序列Fig.3 Sequence of g.1488 C ＞G polymorphism of ACACA gene

通过对比分析发现，位于SCD1 扩增片段的239 bp 处发现一个SNP 位点，即位于SCD1 基因的第5 外显子区域内发生了A/T 碱基突变(图4)，导致239 位点编码的氨基酸由丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val).SCD1 检测的基因区域内有两个等位基因(A 和T)，三种基因型(AA、AT、TT)，将该位点命名为g.239 A＞T.

图4 SCD1 基因g.239 A ＞T 多态性序列Fig.4 Sequence of g.239 A ＞T polymorphism of SCD 1 gene

2.4 遗传多样性指标分析

根据SNP 结果对ACACA基因g.1488C ＞G 位点和SCD1 基因g.239A ＞T 位点进行遗传多态性参数的统计与分析，结果见表2.2 个SNPs 在犏牛群体中均存在三种基因型，且均处于Hardy -Weinberg 平衡(P＞0.05). g.1488C ＞G 的优势基因型为CC 基因型，g.239A ＞T 的优势基因型为AA 基因型. 从多态信息含量上看，g.1488C ＞G 和g.239A ＞T 的PIC分别为0.35 和0.36，均在0.25 ～0.5 的范围内，均为中度多态.表明SNP 位点遗传变异较高，遗传潜力较强.

2.5 SNP 位点与泌乳性能的关联分析

将犏牛的泌乳性能(日产奶量、乳脂率和乳蛋白率)与ACACA基因突变位点的基因型进行关联分析，结果见表3. 位于g.1488C ＞G 位点上的3 个基因型的乳脂率有显著差异(P＜0.05)，GG 型的乳蛋白率显著低于CC 型和CG 型(P＜0.05).其中CG 基因型的乳脂率和乳蛋白率最高.但三个基因型间的日产奶量无显著差异(P＞0.05).

表3 ACACA SNP 位点与产奶性状的关联分析Table 3 The LSM and SE of lactation traits between the ACACA SNP genotypes

将犏牛的泌乳性能与SCD1 基因突变位点上的基因型进行关联分析，结果见表4.在g.239 A ＞T 位点上TA 基因型的乳脂率显著高于其他基因型(P＜0.05)，但日产奶量和乳蛋白率无显著差异(P＞0.05).

表4 SCD1SNP 位点与产奶性状的关联分析Table 4 The LSM and SE of lactation traits between the SCD1 SNP genotypes

3 讨论

在对遗传多态性分析过程中，人们通常把等位基因数、基因型频率、遗传杂合度、纯合度以及多态信息含量作为衡量某个群体遗传变异程度大小的标准，即以上指标数值越大，遗传变异的程度就越高，选择潜力就越强[18].前人的研究主要集中在5'UTR 以及编码区[19-20].本研究发现，犏牛ACACA基因在5'UTR 区域存在一个SNPs 位点，在SCD1 基因的第5 外显子内存在一个突变位点.这两个位点的多态信息含量均为0.25 ＜PIC＜0. 5 具有中度多态信息性，且都处于Hardy-Weinberg 平衡状态，这说明犏牛群体在这两个位点的基因多态性相对较高，遗传突变的程度相对较大，可以获取更多的遗传研究进展. 因此可以利用这两个位点所表现的多态性在犏牛群体中进行筛选.在使用传统育种方法来对这些优良性状选育时，技术周期长且工作量大，同时很难摆脱环境因素影响. 近年来随着分子遗传飞速发展，使得育种人员可以直接从分子方面直接研究基因对性状的影响[21-22].

目前对ACACA基因多态性与泌乳性能的研究，已经揭示了乳脂率和乳蛋白率在ACACA基因作用下存在一定的显著差异. 因此ACACA基因对乳脂率具有一定的影响，但ACACA基因多态性对乳蛋白率的影响的作用机理还需进一步研究. 本试验在犏牛ACACA基因的5'UTR 调控区域处检测到1 个SNP 位点即(g.1488C ＞G)，通过分析该位点与泌乳性能的关联性，结果表明CC、CG、GG 3 种基因型之间在乳脂率以及乳蛋白率上有显著差异.其中CG 基因型乳脂率要明显优于CC 基因型和GG 基因型，GG 基因型的乳蛋白率显著高于CC 基因型和CG 基因型. 通过关联性分析该基因位点与犏牛的泌乳性能密切相关.本试验结果与Artegoitia 等结果一致，均显示在乳脂率上CG 基因型要明显优于其他基因型，但在乳蛋白率上Artegoitia 的研究结果表明三种基因型并没有存在显著差异，与本试验存在一定分歧[23].Kęsek 对ACACA基因多态性的研究表明，g.1488C ＞G 位点对奶牛产奶量有影响[24]，然而，在本试验中显示该位点与犏牛产奶量无显著相关性.本试验与上述两个研究中部分结果不吻合，可能是由于试验牛群的差异所致.

SCD1 基因已被证明与脂肪的合成有关[25-26].李泽等人发现SCD1 基因的过表达显著增加了与脂肪酸和三酰甘油合成的相关基因的表达，导致水牛乳腺上皮细胞中脂肪酸和不饱和脂肪酸含量增加[27]. 本试验在犏牛的SCD1 基因上检测到1 个SNP 位点g.239A ＞T，g.239A ＞T 位点上的TA 基因型在乳脂率方面明显优于其他两个基因型(P＜0. 05)，这与Kęsek 研究结果一致[24]. g. 239A ＞T 位于外显子区域，在此位点发生了错译突变，原来编码的氨基酸由丙氨酸替换为缬氨酸，氨基酸的改变可能导致蛋白质结构的改变，因此导致该位点不同基因型在乳脂率上出现一定的显著差异.目前SCD1 基因在犏牛上的研究鲜有报道，因此该基因可作为犏牛产奶性状的候选基因.

4 结论

本研究筛选了犏牛ACACA基因和SCD1 基因的SNPs 位点，分析发现ACACA基因g.1488C ＞G 位点的CG 基因型和SCD1 基因上g.239A ＞T 位点的TA基因型与乳脂率关联性较高，ACACA基因g.1488C ＞G 位点的GG 基因型在乳蛋白率上存在关联性.因此ACACA基因与SCD1 基因可作为后续犏牛产奶性状辅助选择的候选分子标记.