王翰 邓启民 曾永龙

成都云克药业有限责任公司药物研发部，成都 610225

神经内分泌肿瘤（neuroendocrine tumor，NET）是一类起源于肽能神经元和神经内分泌细胞、具有神经内分泌分化并表达神经内分泌标志物的少见肿瘤，可发生于全身各处，以肺、胃、肠、胰腺NET 最常见[1]。近几十年来，各国流行病学调查结果显示NEM 的发病率呈明显上升趋势[2-3]。放射性核素肽受体介导治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）是通过放射性核素标记的生长抑素类似物与NET 细胞表面过表达的生长抑素受体（somatostatin receptors，SSTR）结合，将放射性药物带至肿瘤细胞，利用药物放射性达到杀灭肿瘤细胞的目的[4]。近些年，在一些单中心的临床研究中，PRRT 表现出了较好的治疗效果和较高的安全性，被认为是不可切除或转移性NET 的一种可选择的治疗方法，受到越来越多的关注[5]。目前，在PRRT 中使用最多和最广的放射性核素为177Lu，但对体积较大的肿瘤来说，其治疗效果不如90Y[6]。在PRRT 的相关药物中，以90Y 和177Lu 标记的生长抑素类似物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-酪氨酸3-奥曲肽（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-Tyr（3）-octreotide，DOTATOC）和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-D-苯丙氨酸1-酪氨酸3-苏氨酸8-奥曲肽（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid-Tyr（3）-octreotate，DOTATATE）的研究最为广泛。其中177Lu-DOTATATE 分别于2017 年和2018 年被欧洲和美国批准上市[7]。90Y-DOTATOC 也正式被用于开展临床研究[8-10]。目前对于90Y-DOTATOC 的药理学评价主要集中在其对不同类型SSTR 的亲和性及其在动物体内分布的研究上[11-12]。90Y-DOTATOC对NET 细胞增殖抑制作用的研究较少。本研究通过采用90Y 标记DOTATOC 后，探讨DOTATOC 和90Y-DOTATOC 对人胰腺神经内分泌瘤BON-1（SSTR+）细胞增殖的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与和仪器

DOTATOC 购自上海强耀生物科技有限公司；90YCl3（无载体）购自成都云克药业有限责任公司；DB1-100 干式恒温器购自上海泰坦科技股份有限公司；Tri-Carb 2810 TR 液闪计数仪购自美国PerkinElmer 公司；UC-2 超声波清洗器购自上海泰坦科技股份有限公司；SpectraMax Plus 酶标仪购自美国Molecular Devices 公司；ITLC-SG 色谱纸购自美国Agilent Technologies 公司；SPE-PAK C18 分离小柱（WAT023501）购自美国Waters 公司；BON-1细胞株购自上海中亚生物研究所。人胰腺胆管瘤PANC-1（SSTR−）细胞株购自美国ATCC 公司。

1.2 实验方法

1.2.190Y 标记DOTATOC

取20 μg DOTATOC 分装于5 ml EP（eppendorf）管中，向EP 管中加入2 ml PBS，超声波混匀。然后再向EP 管中加入37 MBq90Y，震荡混匀。将EP 管放入干式恒温器中，90℃反应30 min。反应结束后取出，冷却约5 min。将EP 管中的反应液移入西林瓶中，采用纯化水稀释至约4 ml。取样，采用纸层析法测定标记率。

1.2.290Y-DOTATOC 纯化

用无菌注射器分别吸取5 ml 70%乙醇和5 ml生理盐水，将注射器前面接头与C18 分离小柱上面连接，缓慢推送注射器，将液体注入废液瓶中。采用同样方法，用无菌注射器分别吸取反应液和2 ml 生理盐水，与C18 分离小柱连接后，将液体推送注入废液瓶中。再次采用同样方法，将无菌注射器分别吸取1 ml 60%乙醇和3 ml 生理盐水，与C18 分离小柱连接后，将液体推送注入产品瓶中，最终得到约4 ml 产品溶液。取样，采用纸层析法测定放射化学纯度，采用液闪计数仪测定放射性比活度。

1.2.390Y-DOTATOC 的稳定性考察

90Y-DOTATOC 在生理盐水中的稳定性考察：取950 μl 生理盐水加入到 2 ml EP 管中，加入纯化后的90Y-DOTATOC 溶液50 μl。在生理盐水中室温保存（20℃），每天测1 次放射化学纯度，直至第7 天。

90Y-DOTATOC 在10%胎牛血清中的稳定性考察：取850 μl PBS 缓冲液加入到2 ml EP 管中，加入100 μl 胎牛血清，再加入纯化后的90Y-DOTATOC 50 μl。水浴37℃保存，每天测1 次放射化学纯度，直至第7 天。

1.2.490Y-DOTATOC 对BON-1 细胞的抑制作用

采用DMEM 或RPMI1640 培养基（含10%胎牛血清）培养BON-1 和PANC-1 细胞，在37℃、5% CO2条件下传代培养。采用MTT 法[13]检测肿瘤细胞的存活率，按照每孔100 μl 含约6 000 个细胞接种于96 孔板。设立阴性对照组、阳性对照组（长春新碱，50 μmol/L）、DOTATOC 组（25 μmol/L）、90Y 组（1.8 MBq/ml）、90Y-DOTATOC 高剂量组（90Y 的放射性浓度为1.8 MBq/ml，DOTATOC 的浓度为25 μmol/L）、90Y-DOTATOC 中剂量组（90Y 的放射性浓度为0.37 MBq/ml，DOTATOC 的浓度为25 μmol/L）、90Y-DOTATOC 低剂量组（90Y 的放射性浓度为0.074 MBq/ml，DOTATOC 的浓度为25 μmol/L）。每孔加入含有各实验组中药物的培养基100 μl，于37℃、5% CO2培养箱中分别培养24 和48 h 后，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl 继续培养4 h。以移液枪吸去上清，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，室温置于摇床10 min，于酶标仪490 nm处测定光密度OD 值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1−OD实验组/OD对照组）×100%。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示。组间对照比较采用独立样本t检验（方差齐）。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 90Y 标记DOTATOC 的结果

90Y 标记DOTATOC 的标记率为（61.93±3.53）%。纯化后90Y-DOTATOC 的放射化学纯度为（98.88±0.38）%，放射性浓度为4.6 MBq/ml，比活度约为1.6 GBq/μmol。

2.2 90Y-DOTATOC 稳定性考察

从表1 可知，随着时间的推移，90Y-DOTATOC在生理盐水和10%胎牛血清中的放射化学纯度降低速度非常缓慢，7 d 后，在生理盐水和10%胎牛血清中的放射化学纯度仍达97.33%和97.02%。

表1 90Y-DOTATOC 在生理盐水和10%胎牛血清中的稳定性考察结果（%）Table 1 Stability test results of 90Y-DOTATOC in physiological saline and 10% bovine serum (%)

2.3 90Y-DOTATOC 对BON-1 细胞的抑制作用

从表2 可知，加药24 h 后，与阴性对照组相比，DOTATOC 组和90Y-DOTATOC 高、中、低剂量组对BON-1 细胞的抑制作用显著增强，且差异均有统计学意义（t=2.654～5.399，均P<0.05）；与阴性对照组比较，90Y-DOTATOC 高、中、低剂量组对PANC-1 细胞的抑制作用显著增强，且差异均有统计学意义（t=2.993～3.984，均P<0.05）；与90Y 组比较，90Y-DOTATOC 高剂量组对BON-1 和PANC-1 细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=2.698、2.973，P=0.031、0.048）；与DOTATOC 组相比，90Y-DOTATOC 高、中剂量组对BON-1 和PANC-1 细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=2.267～3.772，均P<0.05）。加药48 h 后，与阴性对照组相比，90YDOTATOC 高剂量组、中、低剂量组、DOTATOC组、90Y 组对BON-1 细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=2.594～6.155，均P<0.05）；与阴性对照组相比，90Y-DOTATOC 高、中、低剂量组和90Y 组对PANC-1细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=2.110～5.783，均P<0.05）；与90Y 组相比，90Y-DOTATOC 高剂量组对BON-1和PANC-1 细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=3.180、2.728，P=0.042、0.031）；与DOTATOC组相比，90Y-DOTATOC 高、中剂量组对BON-1 和PANC-1 细胞的抑制作用均显著增强，且差异有统计学意义（t=2.615～3.852，均P<0.05）。

表2 90Y-DOTATOC、DOTATOC、90Y 对BON-1 和PANC-1 肿瘤细胞的抑制作用[（±s），%]Table 2 Results of inhibitory effects of 90Y-DOTATOC, DOTATOC, and 90Y on BON-1 and PANC-1 tumor cells [(±s), %]

表2 90Y-DOTATOC、DOTATOC、90Y 对BON-1 和PANC-1 肿瘤细胞的抑制作用[（±s），%]Table 2 Results of inhibitory effects of 90Y-DOTATOC, DOTATOC, and 90Y on BON-1 and PANC-1 tumor cells [(±s), %]

注：DOTATOC 为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-酪氨酸3-奥曲肽；BON-1 为人胰腺神经内分泌瘤细胞；PANC-1 为人胰腺胆管瘤细胞。a 表示与阴性对照组比较，差异有统计学意义（t=2.110～6.902，均P<0.05）；b 表示与90Y 组比较，差异有统计学意义（t=2.698、2.973、3.180、2.728，均P<0.05）。c 表示与DOTATOC 组比较，差异有统计学意义（t=2.267～3.852，均P<0.05）

组别24 h肿瘤抑制率48 h肿瘤抑制率BON-1细胞PANC-1细胞BON-1细胞PANC-1细胞90Y-DOTATOC高剂量组44.12±2.23abc22.65±3.57abc67.73±0.98abc52.33±2.16abc90Y-DOTATOC中剂量组24.23±1.70ac15.56±4.47ac37.08±1.18ac26.39±1.80ac90Y-DOTATOC低剂量组17.94±1.71a10.52±4.08a31.58±1.32a14.15±1.75a DOTATOC组15.17±2.74a5.85±1.5823.43±3.90a8.45±2.33 90Y组8.23±2.117.45±1.8916.43±3.56a15.56±2.88a阳性对照组37.52±1.36a38.10±2.65a64.52±6.05a61.70±3.02a阴性对照组0000

3 讨论

PRRT 是针对不能手术、系统性治疗效果欠佳但SSTR 过表达的 NET 患者的一种有效且安全的治疗方法[14]。在PRRT 相关药物中，以90Y 和177Lu标记的生长抑素类似物DOTATOC 和DOTATATE的研究最为广泛，其中177Lu-DOTATATE 已经获批上市，90Y-DOTATOC 具有很大的研究价值。本研究从细胞层面研究了90Y-DOTATOC 对BON-1（SSTR+）细胞的抑制作用，为90Y-DOTATOC 药物的开发提供了理论依据。

DOTATOC 是一种奥曲肽类似物与螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA）连接后形成的一种化合物，可以被多种放射性核素（90Y、177Lu 等）标记。本研究结果显示，90Y 标记DOTATOC 的标记率较其他文献偏低[15]。其主要原因可能是本研究中的标记工艺条件并非最优，如反应温度、反应时间等。纯化后的90Y-DOTATOC 的放射化学纯度较高，表明纯化方法能有效去除反应液中的游离90Y。90Y-DOTATOC 在生理盐水和10%胎牛血清中的体外稳定性较好，表明标记方法较为温和，对DOTATOC 的破坏程度较小，完全能够满足后续细胞实验要求。

在NET 治疗方面，PRRT 具有诸多独特的优势：（1）利用生长抑素类似物与SSTR 特异性结合的特点在生长抑素类似物上标记放射性核素，可将放射性核素导向SSTR 高表达的肿瘤；（2）在肿瘤原位发挥生物治疗作用，生长抑素类似物可以抑制肿瘤细胞的增殖；（3）可发挥内照射治疗作用，放射性核素发射出β 粒子、俄歇粒子或内转换电子，可直接杀死肿瘤细胞。本研究结果显示，与阴性组对比：（1）DOTATOC 组对BON-1 细胞的抑制作用显著，差异有统计学意义，而对PANC-1 细胞的抑制作用不明显；这可能是因为DOTATOC 能够与BON-1 细胞表面的SSTR 受体结合，对细胞增殖起到一定的抑制作用，而DOTATOC 不能与PANC-1 细胞表面的SSTR 受体结合，对细胞增殖不具有抑制作用；（2）90Y-DOTATOC 对BON-1 和PANC-1 细胞均有不同程度的抑制作用，且抑制效果与90Y 的活度呈剂量依赖关系，这表明90Y 发出的β 射线能有效抑制肿瘤细胞增殖，90Y 活度越大，抑制效果越明显；（3）90Y-DOTATOC 对PANC-1和BON-1 细胞的抑制作用明显强于DOTATOC组；90Y-DOTATOC 高剂量组对BON-1 细胞的抑制率较DOTATOC 组提升约3 倍，这结果表明DOTATOC 通过放射性核素标记后对肿瘤细胞的杀伤作用明显增强；（4）90Y 组因β 射线的作用，对2 组细胞均有一定的抑制作用；但在相同的放射性活度下，90Y 组对2 组细胞的抑制作用明显低于90Y-DOTATOC 组，90Y 组对BON-1 细胞的抑制率约为90Y-DOTATOC 高剂量组的25%。

综上所述，本研究制备的90Y-DOTATOC，标记率、放射化学纯度、体外稳定性均较好，DOTATOC 对BON-1 细胞有较强的亲和力，靶向性较好，对BON-1 细胞有较强的抑制作用，且与90Y 的活度呈现剂量依赖关系。与单独使用DOTATOC或者90Y 对比，90Y-DOTATOC 对BON-1 细胞的抑制作用更强。本研究为将90Y-DOTATOC 开发成一种治疗NET（SSTR+）的药物具有积极意义。

利益冲突所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明王翰负责实验方法的建立、现场实验、论文的撰写；邓启民负责实验方法的建立与现场指导、论文的审阅；曾永龙等负责实验方法的实施、实验结果的收集与统计