李季青 江超 段聪聪 王涛 谢长好 侯传云 李志军

[摘要] 目的 探究臨床常用的3种不同方法全自动自身抗体分析仪检测抗核抗体谱结果的差异。方法 选取2021年4月至5月在蚌埠医学院第一附属医院确诊为系统性自身免疫病（autoimmune disease，AID）的患者72例作为AID组，留取患者相关项目检测剩余的血清样本72份，同时按照性别相同、年龄相近的原则，选取同期体检无AID的31例健康者作为对照组，留取血清样本31份。采用目前临床常用的进口全自动流式点阵发光免疫分析仪（方法A）、国产全自动流式荧光发光分析仪（方法B）和多重液相芯片免疫分析仪（方法C）分别检测两组患者血清样本中的10种抗核抗体，比较3种方法的检测阳性率，分析其阳性符合率、阴性符合率、敏感度、特异性等。为了帮助选择出对临床检验更可靠的方法学及检验设备，对3种方法进行两两比较，进行一致性评价。结果 方法A、B和C与间接免疫荧光法检测的AID组阳性检出率均显著高于对照组（P<0.05）。采用方法A、B和C检测对照组10种抗体的结果均为阴性，AID组10种抗体检测结果中，方法B、C检测抗Sm抗体和抗SSA60抗体的阳性率均显著低于方法A（P<0.05），3种方法检测的其他抗体阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。在方法A与方法B的一致性分析中，二者的平均符合率为92.22%，有1项一致性差，3项一致性一般，6项一致性好；方法A与方法C的一致性分析中，二者的平均符合率为93.89%，有5项一致性一般，5项一致性好；方法B与方法的一致性分析中，二者的平均符合率为92.65%。有1项一致性差，4项一致性一般，5项一致性好。结论 目前两种国产品牌的全自动流式荧光发光分析仪和多重液相芯片免疫分析仪与进口全自动流式点阵发光免疫分析仪检测自身抗体总符合率较高，但是检测血清抗Sm抗体的一致性较差，应密切结合临床与其他实验室指标综合判断。

[关键词] 自身免疫病；抗核抗体；抗核抗体谱；多重微球流式荧光免疫技术；多重液相芯片免疫分析技术

[中图分类号] R466.11      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.002

Analysis of the results of antinuclear antibody spectrum detected by three different methods of automatic autoantibody analyzer

LI Jiqing1， JIANG Chao1， DUAN Congcong1， WANG Tao1，2， XIE Changhao1，2， HOU Chuanyun1， LI Zhijun1，2

1.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College， Bengbu 233000， Anhui， China; 2.Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases， Bengbu 233000， Anhui， China

[Abstract] Objective To investigate the differences in the results of the antinuclear antibody （ANA） spectrum of the three different methods of automatic autoantibody analyzer commonly used in clinical practice. Methods A total of 72 patients diagnosed with systemic autoimmune disease（AID） in the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College from April to May 2021 were selected as the AID group， and 72 serum samples remaining from the patients relevant tests were retained， while 31 healthy individuals without AID in the same period of physical examination were selected as the control group according to the principle of same gender and similar age， and 31 serum samples were retained. The imported automatic flow-type lattice luminescence immunoanalyzer （method A）， domestic automatic flow-type fluorescence analyzer （method B） and multiple liquid phase chip immunoanalyzer （method C） were used to detect 10 antinuclear antibodies in the serum samples of two groups of patients. The positive detection rates of the three methods were compared， and their positive compliance， negative compliance， sensitivity and specificity were analyzed. In order to help select methodologies and test equipment that are more reliable for clinical testing， a two-by-two comparison of the three methods was conducted for consistency evaluation. Results The positive detection rate of the AID group by methods A， B and C and indirect immunofluorescence were significantly higher than those of the control group （P<0.05）. The results of the 10 antibodies detected in the control group by methods A， B and C were all negative. Among the 10 antibodies detected in the AID group， the positive detection rates of anti-Sm antibody and anti-SSA60 antibody by methods B and C were significantly lower than those of method A （P<0.05）， and the differences were not statistically significant when comparing the positive rates of other antibodies detected by the 3 methods （P>0.05）. In the concordance analysis between method A and method B， the mean concordance rate between the two was 92.22%， with one poor concordance， three fair concordances and six good concordances; in the concordance analysis between method A and method C， the mean concordance rate between the two was 93.89%， with five fair concordances and five good concordances， and in the concordance analysis between method B and method 92.65%. There was one poor concordance， four fair concordances and five good concordances. Conclusion At present， the total coincidence rate of automatic flow fluorescence luminescence analyzer and multi-liquid chip immunoanalyzer of two domestic brands is higher than that of the imported automatic flow dot matrix immunoanalyzer. However， the consistency of detecting serum anti-Sm antibodies is poor， and the comprehensive judgment should be closely combined with clinical and other laboratory indicators.

[Key words] Autoimmune disease; Antinuclear antibody; Antinuclear antibody spectrum; Multiplex bead-based flow fluorescence immunoassay; Multiplex liquidchip immunoassay technology

抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）一般是指1组抗核酸（nucleic acid）和核蛋白抗体的总称。ANA可特征性地出现于许多自身免疫性疾病中，对自身免疫病（autoimmune disease，AID）的诊断及鉴别诊断、病情评估与疗效监测等具有重要的临床应用价值[1]。抗核抗体检测的经典方法为间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF），被认为是检测ANA的金标准[2-4]。IIF检测结果阳性后再进行成分分析，即位ANA谱测定[5]。ANA谱测定一般采用蛋白质免疫印迹法，该方法人工操作烦琐，试验时间长，对检验人员技术要求较高，结果只能定性或半定量。为满足临床需求，近年来国内外相继研发了一些如流失荧光、多重磁珠等新技术应用于ANA谱检测[6-7]，但是这些新技术应用的确切效果尚在验证中。为了解目前临床常用于ANA谱测定的新技术及其主要型号检测仪的检测效能与差异，给临床选用提供参考依据，本研究采用目前国内临床应用的3种主流型号免疫分析仪对临床常用ANA谱中10种常用指标进行了检测与分析。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取2021年4月至5月在蚌埠医学院第一附属医院确诊为系统性自身免疫病（autoimmune disease，AID）的患者72例作为AID组，留取患者相关项目检测剩余的血清样本72份，同时按照性别相同、年龄相近的原则，选取同期体检无AID的31例健康者作为对照组，留取血清样本31份。纳入标准：①符合《2020年中国系统性红斑狼疮诊疗指南》[8]诊断标准；②符合《干燥综合征诊断及治疗指南》[9]诊断标准；③符合Bohan和Peter于1975年提出的多发性肌炎和皮肌炎诊断标准[10]；④符合1987年修订的类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）诊断标准分类旧标准和《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》[11]；⑤符合《系统性硬化病诊断及治疗指南》[12]的诊断标准。排除标准：①非首次确诊系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、原发性干燥综合征（primary dryness syndrome，pSS）、皮肌炎/多发性肌炎、RA和系统性硬化症，以及近期有过甲氨蝶呤、青霉胺、环磷酰胺等免疫抑制剂及激素用药治疗史；②妊娠或哺乳期妇女；③精神疾病患者；④恶性肿瘤。观察组中SLE患者22例、pSS 8例、其他结缔组织病42例。两组患者年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：伦科批字[2021]第126号）。

1.2  仪器与试剂

方法A采用美国伯乐BioPlex 2200全自动流式点阵发光免疫分析仪及匹配的ANA谱试剂（抗ds-DNA抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗染色质抗体、抗Sm抗体、抗SmRNP抗体、抗RNP抗体、抗RNPA抗体、抗RNP68抗体、抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体、抗CENP-B抗体、抗Jo-1抗体）、质控、校准品进行检测。方法B采用上海透景TESMI F4000全自动流式荧光发光分析仪及匹配的ANA谱试剂（抗ds-DNA抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗核小体抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗组蛋白抗体、抗线粒体M2抗体、抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体、抗CENP-B抗体、抗Jo-1抗体、抗补体1q抗体、抗多发性肌炎硬皮病抗原抗体）、抗增殖细胞核抗原抗体、质控、校准品进行检测。方法C采用珠海丽珠MCLIA-800 Plus全自动多重液相芯片免疫分析仪及匹配的ANA谱试剂（抗ds-DNA抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗核小体抗体、抗Sm抗体，抗U1-snRNP抗体、抗组蛋白抗体、抗线粒体M2抗体、抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体、抗CENP-B抗体、抗Jo-1抗体、抗Ku抗体、抗Mi-2抗体、抗多发性肌炎硬皮病抗原抗体）、抗增殖细胞核抗原抗体、质控、校准品（方法C）进行检测。

1.3  方法

两组患者的血清样本均冻存于–80℃冰箱中，3个月内解冻，一次性完成有关指标检测。对两组患者所有血清样本进行ANA间接免疫荧光檢测，再分别用3种不同的方法对ANA谱进行检测。其中3种ANA谱检测中，有一个项目检测结果阳性即判断为阳性结果，再选取上述3种方法共有的检测项目，即抗ds-DNA抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体，抗CENP-B抗体、抗Jo-1抗体10个指标作为主要观测指标，所有操作严格按照各方法的操作说明书进行。比较3种方法的检测阳性率，分析其阳性符合率、阴性符合率、敏感度、特异性等。同时，为了帮助选择出对临床检验更可靠的方法学及检验设备，对3种方法两两比较，进行一致性评价。

1.4  统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行处理分析，计数资料采用例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，采用Kappa分析进行一致性评价，Kappa<0.4表示一致性差，0.4≤Kappa<0.75表示一致性一般，Kappa≥0.75表示一致性好，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  不同方法的ANA阳性检出率比较

4种方法检测的AID组阳性检出率均显著高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2  三种不同方法检测AID组主要观测指标的阳性率比较

采用方法A、B、C检测对照组10种抗体的结果均为阴性。采用3种方法检测AID组10种抗体，其中方法B、C检测抗Sm抗体和抗SSA60抗体的阳性率均显著低于方法A（P<0.05）；3种方法检测的其他抗体阳性率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

2.3  三种方法检测结果的一致性分析

对方法A与方法B检测结果进行一致性分析，两种方法检测10项指标的平均符合率为92.22%，抗Sm抗体Kappa<0.4，一致性差；抗RNP抗体、抗SSA60抗体和抗Scl-70抗体，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗体的Kappa≥0.75，一致性好。对方法A与方法C检测结果进行一致性分析，两种方法检测10项指标的平均符合率为93.89%，抗ds-DNA抗体、抗核糖体P蛋白抗体、抗Sm抗体抗Scl-70抗体、抗Jo-1抗体，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗体的Kappa≥0.75，一致性好。对方法B与方法C检测结果进行一致性分析，两种方法检测10项指标的平均符合率为92.65%，抗Sm抗体Kappa<0.4，一致性差；抗ds-DNA抗体、抗RNP抗体、抗SSA60抗体、抗Jo-1抗体，0.4≤Kappa<0.75，一致性一般；其他抗体的Kappa≥0.75，一致性好，见表3～5。

3  讨论

在自身免疫性疾病诊治中，ANA谱检测具有重要的作用，不仅能够协助诊断和鉴别诊断，而且是相关疾病的特异性抗体，如抗ds-DAN抗体，抗Sm抗体等，其在治疗监测、病情评估都有重要临床价值[13-14]。随着医学检验技术的发展，ANA谱检测技术逐渐从原先的只能定性、时间长、不能随机上样、不易自动化发展为定量、高通量，即时检测、无需等待、全智能化和标准化检测。

本研究采用了目前3种最新的全自动检测平台，方法A为全自动流式点阵发光免疫分析仪，方法B为全自动流式荧光发光分析仪，二者均采用液相悬浮芯片技术，其与传统的酶联免疫测定（enzyme linked immunosorbent assay，EIA）不同，传统的EIA检测包被单一抗原，反应时间长，操作烦琐，干扰因素较多，特异性和敏感度有待提高。而方法A和方法B允许在单个试管中同时检测并识别多个抗体，通过荧光编码微球、流式细胞激光检测，全自动检测分析结果。方法C为全自动多重液相芯片免疫分析仪采用激光微雕技术对芯片进行激光光刻，形成“棒状”和“点状”图案的不同组合对磁片进行编码，通过对芯片进行氨基、羧基、生物素等化学基团修饰，进而通过化学交联的方式将抗原连接到磁片上，经过计算机软件计算分析各编码的的荧光强度，实现抗体定量的检测，具有高智能数字化处理、高通量、特异性高、结果准确等优点[8]。本研究结果显示，采用3种方法检测AID组10种抗体，其中方法B、C检测抗Sm抗体和抗SSA60抗体的阳性率均低于方法A，差异均有统计学意义；3种方法检测的其他抗体阳性率比较，差异均无统计学意义，且方法B的对于抗Sm抗体检测的阳性率只有1.39%，低于其他两种方法，出现了不一致，究其原因，可能是不同的检测方法在抗原的来源及纯化方面采用了不同的工艺，导致阳性率产生了较大差异，对结果产生一定影响。

在两两一致性分析方面，方法A与方法B检测10项指标平均符合率为92.22%，方法A与方法C平均符合率为93.89%，方法B和方法C平均符合率為92.65%，具有较好的符合率。方法A与方法B检测10项指标中抗Sm抗体Kappa值为0.120，方法B与方法C检测抗Sm抗体Kappa值为0.125，方法A和方法C抗Sm抗体检测Kappa值为0.573，提示方法A和C一致性优于方法B。在方法A与方法B的一致性分析中有1项一致性差，3项一致性一般，6项一致性好；方法A与方法C的一致性分析中有5项一致性一般，5项一致性好；方法B与方法C的一致性分析中，有1项一致性差，4项一致性一般，5项一致性好。总体来说3种检测方法敏感度和特异性较高，一致性尚可，适用于临床检测。

综上所述，对于自身免疫性疾病自身抗体的检测，3种产品检测结果的一致性差异不大，且自动化程度均较高，能做到高通量，定量化，不同厂家试剂有不同的敏感度和特异性，应根据患者临床表现综合判断，必要时要采用多种方法进一步印证，可避免误诊和漏检。研发更先进的国产免疫分析仪很有必要，相信未来一定会研发出更高性能的全自动自身抗体分析仪为临床诊疗服务。

[参考文献]

[1] 陈振兴， 甄广怀， 李新亮. 等. 多种自身抗体联合检测方法在自身免疫性疾病诊断中的临床意义[J]. 罕少疾病杂志， 2022， 29（4）： 108–112.

[2] 刘清银， 涂斌. 间接免疫荧光法检测抗核抗体的结果分析[J]. 中国卫生产业， 2016， 27（9）： 90–91.

[3] 胡朝军， 周仁芳， 张蜀澜. 抗核抗体检测的临床应用专家共识[J]. 中华检验医学杂志. 2018， 41（4）： 275–280.

[4] DAMOISEAUX J， VON M C A， LA TORRE I G， et al. International consensus on ANA patterns（ICAP）： the bumpy road towards a  consensus on reporting ANA results[J]. Auto Immun Highlights， 2016， 7（1）： 1.

[5] 馮丹丹， 李晶晶. 抗核抗体及抗核抗体谱与自身免疫性疾病的关系[J]. 检验医学与临床， 2020， 17（18）： 2686–2688.

[6] 尚晓莹， 于腾， 孙桂荣， 等. 多重微球流式荧光免疫技术检测抗核抗体谱的评价与临床应用[J]. 中国免疫学杂志， 2019， 35（3）： 331–334.

[7] 程涛， 王慧煜， 梅琳， 等. 悬浮芯片技术应用进展[J]. 生物技术通报， 2011， （9）： 48–51.

[8] 中华医学会风湿病学分会， 国家皮肤与免疫疾病临床研究中心， 中国系统性红斑狼疮研究协作组. 2020中国系统性红斑狼疮诊疗指南[J]. 中华内科杂志， 2020， 59（3）： 172–185.

[9] 中华医学会风湿病学分会， 干燥综合征诊断及治疗指南[J]. 中华风湿病学杂志， 2010， 14（11）： 766–768.

[10] BOHAN A， PETER J B. Polymyositis and dermatomyositis （first of two parts）[J]. N Engl J Med， 1975， 292（7）： 344–347.

[11] 中华医学会风湿病学分会. 2018中国类风湿关节炎诊疗指南[J]. 中华内科杂志， 2018， 57（4）： 242–251.

[12] 中华医学会风湿病学分会. 系统性硬化病诊断及治疗指南[J]. 中华风湿病学杂志， 2011， 15（4）： 256–259.

[13] 王许娜， 边菁， 尹光辉， 等. 联合检测抗核小体、抗双链DNA、抗组蛋白和抗Sm抗体在系统性红斑狼疮诊断中的临床意义[J]. 中国现在医学杂志， 2015， 25（14）： 59–62.

[14] 李长红， 魏琴， 李坤， 等. 抗Sm抗体检测对系统性红斑狼疮及狼疮肾炎的价值[J]. 影像研究与医学应用， 2017， 1（18）： 195–197.

（收稿日期：2022–10–11）

（修回日期：2023–05–09）