张鹏翔，吴佳豪，冀云燕，薛霖莉，董亚洁，宫泽恩，郝晓静，曹校瑞，赫晓燕

（山西农业大学 动物医学学院，山西 晋中 030801）

骨骼肌是动物体重要的组织器官，在人体中占体重的40%。骨骼肌在动物体中行使包括运动、发声、呼吸、内分泌、营养［1］和调节体内离子平衡等在内的多种功能［2］。对于畜牧业来说，肌肉也是重要的产品，因此骨骼肌对人类生活非常重要。大部分脊椎动物肌纤维的数目在出生前就已经确定，出生后纤维只会产生大小和体积的变化，而不会有肌纤维数量上的增加［3］。但是在动物体生活过程中，有很多途径可能导致肌肉损伤，这时就需要肌肉自我修复。肌肉组织的损伤修复主要依靠卫星细胞，卫星细胞是胚胎期一部分成肌细胞附着在肌纤维表面，并且在动物体生长过程中一直保持增殖能力的细胞［4］。卫星细胞一旦被激活就迅速表达MyoD，随后共表达Pax7，M-cadherin 和Myf5，接着细胞进入分裂期开始表达PCNA，而MyoG 的表达标志着细胞进入生肌分化阶段，最后表达的是骨骼肌结构基因actin 和MyHC［5］，它们与损伤肌纤维的残端发生细胞膜融合，标志着生肌分化进入最后时期，细胞损伤修复完成。

生长分化因子11（Growth and differentiation factor 11，GDF11），又名骨形态发生蛋白11（Bone morphogenetic protein，BMP11）是转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成员之一。GDF11 在动物体各个组织器官中均有表达，并且在动物体发育过程中的作用是不可或缺的。在小鼠胚胎发育期GDF11 能够促进神经系统正常发育［6-7］、肢体正确定位［8］；在成年小鼠中GDF11 则承担着抑制成骨细胞分化［9］、保护性腺［10］、支持皮肤修复［11］等多种重要作用。但对于肌肉来说，GDF11 的作用有一些争议：一方面有研究发现，GDF11 能够系统性的调节肌肉衰老，且可以逆转与年龄相关的骨骼肌和干细胞功能障碍［12］。另一方面，还有一些研究认为GDF11 是骨骼肌生长的负调控因子［13-16］。已有的研究证明，GDF11 能够作用于TGF-β/SMAD 信号通路，激活SMAD2/3，参与包括心肌细胞活性调控、骨形成、胚胎发育中的轴向定位、肝再生等众多生理活动［17-20］；在人脐静脉内皮细胞和3T3-L1 脂肪细胞中可以激活SMAD1/5/8 表达［21-22］。对GDF11 激活非SMAD 通路研究显示，GDF11 能够在神经干细胞中激活ERK 和AKT 通路［23］、在脂肪细胞中激活AKT 信号通路［24］、在间充质干细胞和成肌细胞中激活ERK 通路［25-26］。但GDF11 在骨骼肌细胞中能否激活AKT 通路并未得到有效证明。

为了探究GDF11 是否在骨骼肌中发挥积极作用，以及是否作用于AKT 通路发挥作用。本研究以不同发育阶段小鼠和C2C12 细胞为材料，取不同发育阶段小鼠腓肠肌；通过诱导细胞分化和衰老，并在细胞诱导分化过程中转染过表达载体和siRNA 载体、AKT 抑制剂；检测分化和衰老过程中GDF11 的表达量、分化基因MyoG、以及AKT 通路蛋白表达量，以探究GDF11 对骨骼肌细胞生长发育的影响及其在其中激活的非SMAD 调控通路，以期为肌肉发育提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物和细胞

小鼠为C57BL/6，来源于山西省人民医院实验动物中心；小鼠胚胎肌母细胞C2C12 细胞，来源于中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试验试剂

DMEM 购自以色列BI；Lipofectamine 2000 转染试剂购自中国赛默飞；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、胎牛血清等均购自中国碧云天；特级马血清、DMSO 等购自中国索莱宝。

C2C12完全培养基：DMEM+10%胎牛血清+1%青链霉素。C2C12 分化培养基：DMEM+2%特级马血清+1%青链霉素。C2C12 细胞冻存液：完全培养基+5%DMSO，现配现用。

一 抗 ：GAPDH（60004-1-AP）、β -actin（20536-1-AP）购自美国proteintech 公司；GDF11（48224）、AKT（14252）、MyoG（54416）购自中国SAB；p-AKT（4060）购自美国cell signaling technology。二抗：山羊抗兔（abs2002）、山羊抗鼠（abs2001）购自中国优宁维。

1.2 方法

1.2.1 动物饲养和取材

从山西省人民医院实验动物中心购入2 周龄和6 周龄C57BL/6 小鼠，给予充分饮食和饮水，光照时长为每日12 h。对于2 周龄小鼠，直接断颈处死，取腓肠肌，液氮冷冻备用。对于6 周龄小鼠，将其随机分为3 组，每组6 只，饲养至相应发育阶段（7 周龄、10 周龄和15 月龄）后断颈处死，取腓肠肌，液氮冷冻备用，用于蛋白印迹试验。

1.2.2 C2C12 细胞培养及分化

冻存的C2C12 细胞复苏后，用完全培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。当细胞密度达到95% 时，传代到6 孔板中，培养至细胞密度达到80%时，更换为分化培养基进行细胞分化。在分化后的1、3、5、7 d 分别收取3 孔细胞蛋白样品，用蛋白免疫印迹法检测GDF11 在不同分化时间的表达。

1.2.3 C2C12 细胞衰老诱导及检测

在分化培养基中添加D-半乳糖，使其中D-半乳糖终浓度分别为0、5、10、20 和40 mg·mL-1，配置衰老诱导培养基。首先诱导C2C12细胞分化7 d，使其分化出明显肌管；然后更换为衰老诱导培养基，分为5 组，每组3 孔细胞继续培养。观察细胞状态、使用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒对细胞衰老诱导结果进行分析，同时蛋白免疫印迹法分析不同衰老时间GDF11 的表达。

1.2.4 C2C12 细胞转染

当6 孔板中细胞密度达到80%时，更换为不含双抗的完全培养基。用DMEM 稀释过表达GDF11 载体、siRNA 载体和Lipofectamine 2000 转染试剂；将转染试剂和载体混合后静置一段时间，滴加转染混合液轻轻摇晃使其混匀。培养6 h 后更换为分化培养基继续培养，并观察细胞分化情况。

1.2.5 细胞通路阻断试验

将AKT 通路抑制剂LY294002 用DMSO 溶解，在分化培养基中按照0.01%的比例添加抑制剂，4 ℃备用。将细胞分为7 组，每组3 孔。对照组：分化培养；空载组：转染空载质粒后分化培养；空载+DMSO 组：转染空载质粒后用添加了DMSO 的分化培养基培养；过表达组：转染过表达质粒后分化培养；过表达+DMSO 组：转染过表达质粒后用添加了DMSO 的分化培养基培养；LY294002 组：用含LY294002 的分化培养基培养；过表达+LY294002 组：转染了过表达质粒后用含LY294002 的分化培养基培养。6 h 后收取细胞蛋白样品，蛋白免疫印迹法检测细胞分化状态。

1.2.6 蛋白免疫印迹检测

样品为提取的小鼠腓肠肌蛋白和C2C12 细胞蛋白。取适量样品加蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min使蛋白样品变性。随后进行SDS-PAGE 胶凝胶电泳，结束后转印至PVDF 膜上，5%封闭液室温摇床封闭1 h。洗去封闭液后加入一抗孵育液，4 ℃摇床孵育12～16 h；洗去一抗孵育液，加入二抗孵育液37 ℃摇床孵育1 h；洗去二抗孵育液。用ECL 发光液曝光，用Image J 图像分析软件分析蛋白条带灰度值。根据条带灰度值和面积，分析蛋白表达水平。

2 结果与分析

2.1 GDF11在不同发育阶段小鼠腓肠肌中的表达

如图1 所示，与幼龄期（2 周龄）小鼠相比，性成熟（7 周龄）和体成熟期（10 周龄）小鼠腓肠肌内GDF11 表达量显著降低（P＜0.05），并且性成熟期和体成熟期之间无差异，老龄期（15 月龄）小鼠腓肠肌GDF11 表达量显著增多（P＜0.05）。

图1 GDF11 在不同发育阶段小鼠腓肠肌中的表达Fig. 1 Expression of GDF11 in mouse gastrocnemius muscle at different growth stages

2.2 C2C12 细胞成肌分化过程中伴随着GDF11的变化

在7 d 的分化过程中，可以看到细胞逐渐融合，形成清晰可见的肌管；在分化形成肌管的过程中，成肌细胞不断融合、肌管逐渐变粗（图2A）。随后对C2C12 细胞在不同分化时间阶段中的GDF11 表达量进行检测，结果如图2B 所示，在分化前期GDF11 表达量逐渐上升但与0 d 相比无显著差异；3 d 的GDF11 表达量显著升高（P＜0.001），随后开始逐渐下降，7 d 时GDF11 的表达量与1 d 无显著差异。

图2 GDF11 在C2C12 成肌细胞分化过程中的表达Fig. 2 Expression of GDF11 during C2C12 myoblast differentiation

2.3 肌管细胞衰老过程中伴随着GDF11 的变化

细胞形态观察和β-半乳糖苷酶染色试验结果显示，D-半乳糖导致C2C12 细胞衰老呈现剂量依赖性，高浓度的D-半乳糖更能诱导细胞衰老，并导致细胞数量减少（图3A～3B）。检测衰老过程中GDF11 的表达情况，结果显示，随着D-半乳糖浓度的升高，GDF11 表达量也逐渐升高，并且在D-半乳糖浓度为40 mg·mL-1时达到最高（图3C～3F）。

图3 GDF11 在C2C12 细胞衰老过程中的表达变化Fig. 3 Expression of GDF11 in C2C12 cells during senescence

2.4 转染GDF11 过表达载体和siRNA 载体对C2C12 细胞成肌分化的影响

转染了GDF11 过表达载体和siRNA 载体（Si-GDF11）的细胞分化形态显示，对照组和转染了空载质粒的C2C12 细胞在分化3 d 就展现出分化迹象，并且在分化形成肌管的过程中，不断融合、形成肌管，并且肌管逐渐变粗；而转染了过表达载体的C2C12 细胞，则在9 d 才展现出分化迹象（图4A）。在转染了Si-GDF11 的细胞中，观察到C2C12 细胞分化进程并没有明显改变，3 d 内表现出与对照组相同的分化状态（图4B）。

图4 过表达和沉默GDF11 对C2C12 细胞分化的影响Fig. 4 Effects of overexpression and silencing of GDF11 on C2C12 cell differentiation

2.5 阻断AKT 信号通路对GDF11 造成C2C12细胞成肌分化抑制的影响

在C2C12 细胞转染了过表达GDF11 载体的基础上，向其中加入了LY294002。结果显示，过表达GDF11 能够导致AKT 的磷酸化水平显著升高，添加抑制剂能够降低AKT 的磷酸化水平，但并未能恢复到对照组的同等水平。对MyoG 进行检测，结果显示，过表达GDF11 显著降低了MyoG的表达，在过表达GDF11 的基础上添加LY294002 的能够提高MyoG 基因在C2C12 细胞中的表达（图5A～5B）。

图5 GDF11 影响C2C12 细胞分化的通路分析Fig. 5 The pathway of GDF11 affecting C2C12 cell differentiation

3 讨论

GDF11 作为广泛表达在哺乳动物各组织器官中的一种细胞因子，在动物体发育过程中不可或缺。在前人的研究中，对GDF11 与肌肉的关系有着不同的认识，有研究显示，GDF11 是恢复老年小鼠肌肉活力的活性因子［12］、对心肌也有保护作用［27］。但另外的研究显示，GDF11 则会导致骨骼肌和心肌的体积减小，对骨骼肌的发育有抑制作用［16］。本试验结果显示，GDF11 表达量在不同年龄段小鼠中有差异，并且老龄小鼠中GDF11 表达量更高。这说明骨骼肌内GDF11 蛋白丰度与年龄呈现负相关性。

在前人的研究中，探究过GDF11 与C2C12 细胞胰岛素抵抗之间的关系［28］、GDF11 与成骨细胞分化的关系［29］。本试验使用马血清构建体外骨骼肌分化模型，探究GDF11 对C2C12 细胞成肌分化的影响；结果显示，在C2C12 细胞分化的过程中，GDF11 在分化前期表达量升高，随后减少并在7 d恢复最初的水平。根据前人研究［30］，使用D-半乳糖构建体外骨骼肌衰老模型，在处理过程中观察到C2C12 细胞的衰老与D-半乳糖呈现剂量依赖性；对GDF11 的检测结果显示，衰老的C2C12 细胞GDF11 的表达量更高；这个结果显示了C2C12细胞的衰老过程中伴随着GDF11 的表达，与体内试验相一致。为了进一步探究GDF11 对骨骼肌细胞分化的影响，本试验向C2C12 细胞中转染了GDF11 过表达载体和Si-GDF11，再对细胞进行分化；这一试验结果显示，在转染了GDF11 过表达载体的C2C12 细胞中，细胞分化时间推迟了数天；转染了Si-GDF11 的C2C12 细胞，细胞分化状态与对照组并无不同。同时，在对MyoG 的检测中发现，过表达GDF11 会导致MyoG 基因表达量显著降低。这个结果显示，GDF11 能够抑制C2C12 细胞分化。

Hammers 等［16］在研究中表明，GDF11 结合ActRⅡB 激活SMAD2/3 从而诱导骨骼肌萎缩；Wang 等［20］发现GDF11 在神经干细胞中激活MAPK 信号通路；Lu 等［24］发现GDF11 在脂肪组织中激活AKT 和AMPK 信号通路从而促进脂肪棕色化；Masuzawa 等［25］发现GDF11 能够激活ERK信号通路从而引起骨骼肌细胞分化抑制或肌肉萎缩。本试验运用AKT 通路阻断剂LY294002 探究GDF11 能否在成肌细胞中激活AKT 信号通路。在过程中用LY294002 处理3 天C2C12 细胞，结果发现这种处理条件下细胞不仅在处理期间不分化，而且在处理结束后依然不分化，这可能是由于LY294002 诱导了细胞凋亡。 因此本试验将LY294002 的处理时间减为了6 h，结果发现处理结束后C2C12 细胞能够正常分化。随后对过表达GDF11 的细胞中添加LY294002 结果发现，过表达GDF11 会导致AKT 磷酸化水平上升和MyoG水平下降，而添加LY294002 会显著降低AKT 的磷酸化水平并提高MyoG 表达水平，但均未能恢复到对照组的同等水平。这一结果表明，GDF11在C2C12 成肌细胞中能够抑制骨骼肌细胞分化和激活AKT 信号通路，阻断AKT 信号通路能够逆转GDF11 抑制骨骼肌细胞分化的情况。

综上，本研究从C2C12 成肌细胞层面探究了GDF11 对骨骼肌细胞分化和生长发育的影响，发现GDF11 能够通过AKT 信号通路抑制了骨骼肌发育，这为进一步探究GDF11 的生理功能提供了理论基础。

4 结论

本研究对GDF11 在骨骼肌细胞分化和衰老过程中发挥的作用和激活通路进行分析，结果表明，GDF11 的表达量与骨骼肌细胞衰老程度呈正相关，并且GDF11 能够抑制骨骼肌细胞分化，是骨骼肌生长和发育的负调控因子，可以通过激活AKT通路发挥作用，为揭示GDF11 影响骨骼肌生长发育的分子调控机制提供理论支持。