田家豪　石悰悰　费素娟

摘要 目的：探究小檗堿对慢性萎缩性胃炎（CAG）的改善作用及其作用机制。方法：将SD大鼠随机分为对照组、模型组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组和DUSP19组，每组9只。除对照组外均构建CAG模型，小檗碱低、中、高剂量分别灌胃给与25、50、100 mg/kg的小檗碱，DUSP19组灌胃给与100 mg/kg的小檗碱和尾静脉注射JAK激酶2/信号转导及转录激活因子3（JAK2/STAT3）通路激活剂DUSP19 100 μmol/L。苏木精-伊红（HE）染色法检测病理学变化;蛋白质印迹法检测JAK2/STAT3信号通路及凋亡相关蛋白表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清相关因子表达水平;原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测胃黏膜细胞凋亡。结果：与模型组比较，小檗碱观察组磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化JAK3（p-JAK3）、胃动素（MTL）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）、内皮素（ET）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）、裂解胱天蛋白酶3（Cl-caspase-3）、裂解胱天蛋白酶9（Cl-caspase-9）水平及细胞凋亡率显著降低（P<0.05），胃泌素（GAS）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、谷胱甘肽（GSH）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）水平显著升高（P<0.05）;JAK2/STAT3通路激活剂DUSP19可显著扭转小檗碱对上述指标的影响（P<0.05），且HE结果显示小檗碱可显著改善CAG大鼠胃组织病理病变。结论：小檗碱可通过JAK2/STAT3信号通路抑制细胞凋亡和炎症反应减轻大鼠慢性萎缩性胃炎。

关键词 小檗碱;慢性萎缩性胃炎;JAK2/STAT3信号通路;信号通路;凋亡;炎症反应;病理病变;大鼠

Berberine Attenuates Chronic Atrophic Gastritis in Rats by Inhibiting Apoptosis and Inflammation

TIAN Jiahao，SHI Congcong，FEI Sujuan

（Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，China）

Abstract Objective：To investigate the ameliorative effect of berberine on chronic atrophic gastritis（CAG） and its mechanism.Methods：SD rats were randomly divided into a control group，a model group，a low-dose berberine group，a medium-dose berberine group，a high-dose berberine group，and a DUSP19 group，with 9 rats in each group.Except the control group，CAG models were constructed.Berberine was given 25，50，and 100 mg/kg by gavage at low，medium，and high doses，respectively.The DUSP19 group was given 100 mg/kg of berberine by gavage and the tail vein was injected with 100 μ mol/L DUSP19，the protein tyrosine kinase 2/cytoplasmic transcription factor 3（JAK2/STAT3） pathway activator.The pathological changes were detected by hematoxylin-eosin（HE） staining.Western blot was used to detect the JAK2/STAT3 signaling pathway and apoptosis-related protein expression.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the expression level of serum-related factors.The apoptosis of gastric mucosa cells was detected by TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling（TUNEL）.Results：As compared with the model group，the levels of phosphorylated protein tyrosine kinase 2（p-JAK2），phosphorylated protein tyrosine kinase 3（p-JAK3），motilin（MTL），and tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin 6（IL-6），and interleukin 1β（IL-1β），prostaglandin E2（PGE2），endothelin（ET），B-lymphoma toma-2 associated X protein（Bax），cystatin 3（Cl caspase-3），and cystatin 9（Cl caspase-9） and the cell apoptosis rate were significantly decreased（P<0.05），while the levels of gastrin（GAS），secretory immunoglobulin A（sIgA），glutathione（GSH），and B-lymphomatoma-2（Bcl-2） were significantly increased（P<0.05）.DUSP19，the activator of JAK2/STAT3 pathway，significantly reversed the effect of berberine on the above indexes（P<0.05），and HE results showed that berberine significantly improved the pathological changes in gastric tissues in rats with CAG.Conclusion：Berberine can alleviate CAG in rats by inhibiting apoptosis and inflammation through the JAK2/STAT3 signaling pathway.

Keywords Berberine; Chronic atrophic gastritis; JAK2/STAT3; Signaling pathway; Apoptosis; Inflammatory reaction; Pathological changes; Rats

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.02.008

慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是全球各国人类最为常见的一种消化系统疾病，CAG的特点是肠型胃癌的癌前病变，发病率较高［1］。近年来，CAG的发病率呈不断上升趋势，而临床患者的平均年龄却在下降［2］。当与肠上皮化生、异型增生相关时，癌变风险就会增加，并将导致临床治疗困难［2-3］。因此，迫切需要对CAG进行有效的治疗，以抑制CAG的进展，防止其早期向胃癌转变。随着研究的深入，有报道证实中药治疗CAG具有潜力［4-5］。小檗碱是一种异喹啉类生物碱，主要存在于芸香科、毛莨科、小檗科等植物中，研究已经证实小檗碱具有广泛的药用价值，研究表明小檗碱在治疗胃炎、肠炎等消化系统疾病上具有显著的疗效和广阔的应用前景［6-7］。然而小檗碱治疗CAG的作用机制仍不十分清楚，多个研究已经证实JAK激酶2/信号转导及转录激活因子3（Janus Kinase 2/SignalTransducer and Activator of Transcription 3，JAK2/STAT3）信号通路在CAG发生发展中扮演重要角色，且有研究证实小檗碱可通过调控JAK2/STAT3通路抑制足细胞凋亡［8-9］，但小檗碱是否可介导JAK2/STAT3信号通路在CAG中是否发挥作用还未可知。本研究将通过构建CAG大鼠动物模型探究小檗碱对CAG的保护作用及其作用机制，为CAG的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取60只8周龄雄性无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级SD大鼠，体质量180～220 g，由徐州医科大学动物实验中心提供，生产许可证号为SCXK（苏）2020-0011，SD大鼠饲养于徐州医科大学实验动物房，使用许可证号：SYXK（苏）2021-0038，温度18～26 ℃，相对湿度40%～70%，通风换气8～12次/h，昼夜12 h，自由进食和饮水。本实验获得徐州医科大学动物伦理委员会的批准（伦理审批号：202103A411）。

1.1.2 药物 小檗碱（上海源叶生物科技有限公司，货号：S30593-5 g，纯度：95%）。

1.1.3 试剂与仪器 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基（1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine，MNNG）（日本东京化成工业株式会社，日本，批号：M2527）;JAK2/STAT3通路激活剂DUSP19（Sigma公司，美国，批号：20210812）;苏木精-伊红染色液（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）;JAK2、磷酸化JAK2（Phosphorylated Janus Kinase 2，P-JAK2）、JAK3、磷酸化JAK3（Phosphorylated JAK 3，P-JAK3）、B淋巴细胞瘤-2（B Lymphoma-2，Bcl-2）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bcl-2 Assaciated X Protein，Bax）、裂解胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3，Cl-caspase-3）和裂解胱天蛋白酶9（Cleaved Caspase-9，Cl-caspase-9）一抗军由英国Abcam公司生产，货号：ab108596、ab32101、ab45141、ab278789、ab32124、ab32503、ab32042、ab202068;山羊抗兔二抗由上海优宁维生物科技股份有限公司生产，货号：7074；酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）試剂盒（上海联祖生物科技有限公司，货号：ml862256，ml058957，ml059055，ml102828，ml037361，ml003136，ml059475，ml003036，ml025101）;TUNEL试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司生产，货号：ZY81026）。酶标仪（Bio-Tek公司，美国，ELx800型）;Western-Blot成像系统购自（BIO-RAD公司，美国，型号：ChemiDoc MP）;倒置显微镜（奥林巴斯有限公司，日本，型号：IX73）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 所有大鼠均适应性饲养1周后，随机选取9只大鼠给与普通饲料进行喂养，并自由饮水作为对照组。其余大鼠均给与MNNG（180 μg/mL）饮水，灌胃给与2%的水杨酸钠液，以及1 d自由禁食+1 d限食喂养，持续干预12周以后随机抽取2只大鼠进行胃组织病理学观察，胃组织病理学显示CAG改变即为建模成功［10］。在建模中共死亡3只大鼠。将建模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组和DUSP19组，每组9只。

1.2.2 给药方法 小檗碱低、中、高剂量组大鼠分别灌胃给予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的小檗碱，DUSP19组给与100 mg/kg的小檗碱并尾静脉注射JAK2/STAT3信号通路激活剂DUSP19 100 μmol/L，对照组大鼠灌胃给与等量的生理盐水。持续给药8周后，所有大鼠禁食水24 h后麻醉，股动脉采血后切取胃组织保存。

1.2.3 检测指标与方法 1）苏木精-伊红（Hematoxylin Eosin，HE）染色法检测胃组织病理学变化。取各组大鼠部分胃组织，使用多聚甲醛进行固定，脱水后用石蜡包埋，并将组织切片切成5 μm的小切片，置于载玻片上然后使用HE染色法进行常规形态学观察。2）蛋白质印迹法检测JAK2/STAT3信号通路及凋亡相关蛋白表达。取胃组织，使用裂解液裂解提取总蛋白，BCA法定量后取适当蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE），转膜后使用5%的脱脂奶粉室温封闭，120 min后加入稀释的一抗试剂（1∶1 000），4 ℃冰箱里培养过夜，第2天PBST洗膜后加入二抗培养90 min后洗膜，然后进行ECL法显色，曝光，使用Image J软件做灰度值分析。3）酶联免疫吸附试验检测相关因子表达水平。收集各组大鼠血液，离心后（3 000×g，10 min），取血清，然后按照酶联免疫吸附试验操作说明检测相关指标水平：每孔加入100 μL上清液，培养2 h后洗板，然后加入生物素抗体100 μL，室温培养60 min，洗板后加入三甲氧基苯甲酰基（Trimethoxybenzoyl，TMB）进行显色，然后遮光孵育15 min，加入终止液后检测光密度值，绘制标准曲线计算胃泌素（Gastrin，GAS）、胃动素（Motilin，MTL）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，sIgA）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）和内皮素（Endothelin，ET）含量。4）TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡情况：使用TUNEL FITC凋亡试剂盒对胃黏膜细胞进行TUNEL染色，使用多聚甲醛进行固定30 min后，磷酸盐缓冲液（Phosphate-Buffered Saline，PBS）清洗，然后滴加抗地高辛抗体（过氧化物酶标记），30 min后PBS清洗，使用0.05%的DAB试剂染色5 min，清洗后使用甲基绿进行复染，二甲苯脱水后在400倍绿色荧光显微镜下观察细胞凋亡。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验，多组比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小檗碱对各组大鼠胃组织病理学变化的影响观察各组大鼠胃组织病理学变化，与对照组比较，模型组大鼠胃组织出现囊性扩张、排列不规则、炎症细胞浸润等现象。经小檗碱治疗后，上述症状均呈剂量依赖性改善，表现为炎症细胞浸润明显减少，排列规则。这些结果提示小檗碱可以减轻CAG大鼠胃组织的组织学损伤。见图1。

2.2 小檗碱对JAK2/STAT3信号通路的影响 WB检测各组大鼠胃組织中相关蛋白表达情况。与对照组比较，模型组p-JAK2和p-JAK3蛋白水平均显著升高（P<0.05）;与模型组比较，小檗碱低、中、高剂量组p-JAK2和p-JAK3蛋白水平均显著降低（P<0.05）;与小檗碱高剂量组比较，DUSP19组p-JAK2和p-JAK3蛋白水平均明显升高（P<0.05）。而各组JAK2和JAK3蛋白水平差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2，表1。

2.3 小檗碱对各组大鼠胃肠激素和血清炎症介质水平表达的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清GAS水平显著降低（P<0.05），而MTL、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）;与模型组比较，小檗碱低、中、高剂量组GAS水平显著增加（P<0.05），而MTL、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著下降（P<0.05）;与小檗碱高剂量组比较，DUSP19组大鼠血清GAS水平显著降低（P<0.05），而MTL、TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高（P<0.05）。见表2。

2.4 小檗碱对各组大鼠胃黏膜保护因子和破坏因子表达水平的影响 与对照组比较，模型组大鼠血清保护因子sIgA和GSH水平均显著降低（P<0.05），而血清破坏因子PGE2和ET水平均显著增加（P<0.05）;与模型组比较，小檗碱低、中、高剂量组sIgA、GSH水平显著升高（P<0.05），而PGE2和ET水平均显著减少（P<0.05）;与小檗碱高剂量组比较，DUSP19组sIgA、GSH水平明显回落（P<0.05），而PGE2和ET水平均明显回升（P<0.05）。见表3。

2.5 小檗碱对各组大鼠胃黏膜细胞凋亡的影响 对照组、模型组、小檗碱低剂量组、小檗碱中剂量组、小檗碱高剂量组和DUSP19组凋亡率分别为：（2.44±0.05）%、（34.48±3.84）%、（23.01±2.79）%、（17.15±1.06）%、（7.43±0.61）%和（30.14±2.59）%。与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），而低、中、高剂量小檗碱处理后，细胞凋亡率均显著降低（P<0.05）;与小檗碱高剂量组比较，DUSP19组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）。TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡情况，与对照组比较，模型组TUNEL标记的凋亡细胞（绿色荧光）显著增多，表明模型组大鼠胃黏膜细胞凋亡率增加。见图3。

2.6 小檗碱对各组大鼠凋亡相关蛋白表达的影响与对照组比较，模型组大鼠Bcl-2蛋白量明显降低（P<0.05），而Bax、Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）;与模型组大鼠比较，小檗碱低、中、高剂量组Bcl-2蛋白量明显升高（P<0.05），而Bax、Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与小檗碱高剂量组比较，DUSP19组Bcl-2蛋白量明显降低（P<0.05），而Bax、Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）。见图4，表5。

3 讨论

CAG是主要以胃黏膜变薄、局部（广泛）固有腺体消失、胃黏膜基层变厚等为主要特征的消化系统疾病，是一种慢性胃炎，近十多年来，中医药专家在CAG的治疗上进行了广泛的研究，在中医理论中认为CAG的发生与饥饱失常和饮食不节或情志怫郁，嗜酒吸烟等危险因素相关［11-12］。中药在治疗CAG上的疗效已得到证实，如褚雪菲等［13］在研究中证实芍药甘草汤可明显促进CAG患者胃黏膜修复，改善病理组织学病变，进而减轻CAG患者临床症状，提高生命质量。

小檗碱是一种异喹啉类生物碱，其在黄柏和黄连中含量较高，又名黄连素，最早的研究发现小檗碱具有显著的抗菌效果，随着研究的深入，小檗碱广泛的药理活性逐渐被发现［14］，王诗鹭等［15］在研究中发现小檗碱可通过调控CAG患者血清血管内皮生长因子和胃蛋白酶原水平改善CAG患者临床症状，本研究发现小檗碱可明显改善CAG大鼠动物模型胃组织病理病变，且发现小檗碱可明显上调CAG大鼠血清GAS，抑制MTL及炎症介质TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，研究已经证实GAS是胃黏膜的主要营养物质，在胃黏膜营养和保护作用中起着重要作用，此外，MTL是一种重要的与胃动力有关的胃肠激素，可诱导胃强烈收缩，促进胃蛋白酶的分泌和食物消化［16］。同时，本研究还发现小檗碱可上调CAG大鼠血清保护因子sIgA、GSH表达并抑制破坏因子PGE2和ET的表达。本研究提示小檗碱可对MNNG联合不规律饮食引起的CAG有一定的保护作用。

进一步探究小檗碱对CAG的作用机制，结果发现小檗碱给药后，CAG大鼠胃组织中p-JAK2和p-JAK3蛋白水平显著降低，研究表明JAK2、STAT3是JAK2/STAT3信号通路的关键蛋白，IL-6可激活JAK2蛋白并增加JAK2磷酸化水平，进而磷酸化下游STAT3水平，参与机体的细胞凋亡、炎症反应等生理病理进程［17-18］。王文娟等［8］也在研究发现抑制JAK2/STAT3信号通路可缓解CAG大鼠胃黏膜损伤，基于此我们推测小檗碱可能也是通过抑制JAK2/STAT3信号通路发挥作用。为了证实我们的推测，使用JAK2/STAT3信号通路激活剂DUSP19处理CAG大鼠，结果发现DUSP19处理后，小檗碱对CAG大鼠炎症反应、sIgA、GSH、PGE2、ET水平的调控作用明显减弱，此外我们还发现，DUSP19可显著削弱小檗碱对胃黏膜细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cl-caspase-3、Cl-caspase-9表达的影响。这表明小檗碱可通过抑制JAK2/STAT3通路改善CAG大鼠炎症反应和细胞凋亡。

综上所述，小檗碱可通过JAK2/STAT3信号通路抑制胃黏膜细胞凋亡和炎症反应减轻大鼠慢CAG，然而关于小檗碱对CAG的保护作用机制是复杂的，本研究对小檗碱的作用机制的探讨仍存在局限性，因此需要大量的实验进一步探究小檗碱对CAG的作用机制。

利益冲突声明：无。

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（2022-08-26收稿 本文编辑：王明）

基金项目：2021年江苏省科研与实践创新计划项目（SJCX21_1146）作者简介：田家豪（1996.09—），男，硕士研究生在读，研究方向：消化病学研究，E-mail：doc_tianjh@163.com通信作者：费素娟（1963.10—），女，硕士，主任医师，教授，研究方向：消化病学研究，E-mail：xyfyfeisj99@163.com