方光远 谈福利 张智敏 单星月 袁光苏 王喜国 陈俊红 胡志华 蒋加进 戴鼎震

摘要：为研究20日龄左右仔猪腹泻发病机理，检测仔猪腹泻大肠杆菌耐药性和超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）基因种类，分析仔猪腹泻大肠杆菌耐药特性，为兽医临床更好地预防控制仔猪腹泻大肠杆菌病提供参考，从腹泻发病仔猪粪便中分离出34株致病性仔猪腹泻大肠杆菌，用10种头孢类抗生素药敏纸片对其进行药物敏感试验，并设计针对ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9的特异性引物，检测34株仔猪腹泻大肠杆菌ESBLs基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9存在情况。药敏试验结果表明，34株仔猪腹泻大肠杆菌对10种头孢类抗生素的敏感度不同，其中，对头孢唑啉、头孢噻吩、头孢呋辛的耐药率为68%、65%和56%，敏感率为29%、15%和35%；对头孢哌酮、氨曲南的耐药率为15%、9%，敏感率为70%、79%。ESBLs基因检测结果表明，34株仔猪腹泻大肠杆菌全部检测到TEM耐药基因，检出率为100%；检测到1株细菌具有CTX-M-9耐药基因，检出率为2.8%。由于该养猪场分离出的仔猪腹泻大肠杆菌对头孢类抗生素普遍耐药，并且全部检测出ESBLs的TEM基因，因此建议对养猪场的头孢类抗生素使用应定期进行耐药性检测和合理规范使用。

关键词：仔猪腹泻大肠杆菌；耐药性；超广谱β-内酰胺酶基因；检测与分析

中图分类号：S852.6文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）10-0053-04

大肠杆菌对头孢菌素产生耐药性的主要机理是产生超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）。ESBLs是通过质粒介导使细菌对第3、4代头孢菌素（主要包含头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶和头孢吡肟等）及单环类内酰胺抗生素氨曲南和青霉素类抗生素产生耐药的一组酶［1-2］。自从19世纪80年代欧洲国家发现并报道了第1例产ESBLs菌株后，目前已发现由质粒介导的ESBLs基因亚型200多种，其中，TEM（Temoniera）、SHV（Sulphadrylvariable）和CTX-M（Cefotaxime）基因型非常普遍［2-3］。根据基因同源性的差异把ESBLs分成三大类：TEM型、SHV型、非TEM非SHV型，其中，TEM型和SHV型占大多数。最近，伴随CTX-M型不断增加，且本来属于2d亚类β-内酰胺酶OXA型中又出现了多种ESBLs，所以又把ESBLs分类为TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型、其他5种类型［4-5］。ESBLs最常见的基因型是TEM，至今已有168种，全球广泛分布。目前，我国滥用抗生素现象非常普遍，对超广谱β-内酰胺酶的研究较晚，抗生素产生耐药性的现象比较普遍。本试验通过检测仔猪腹泻大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶基因型种类，分析仔猪腹泻大肠杆菌的耐药机理，为兽医临床提供参考。

1材料与方法

1.1材料

试验时间：2021年12月10日至2022年4月10日；地点：金陵科技学院动物科学与食品工程学院兽医微生物实验室。

1.1.1病料南京某养猪场34份仔猪腹泻粪便［3］。

1.1.2菌株34份腹泻仔猪粪便进行细菌分离培养获得34株细菌，经鉴定均为仔猪腹泻大肠杆菌［3］，冻干保存备用。

1.1.3试剂琼脂糖、2×TaqPCRmix、DL2000DNAMarker等购自南京擎科生物有限公司；普通营养琼脂平板、SS琼脂平板、普通營养肉汤等自行配制。

1.2方法

1.2.1细菌复苏纯化培养取保存的34株仔猪腹泻大肠杆菌冻干菌种，接种普通营养琼脂平板、SS琼脂平板和普通营养肉汤，放入培养箱内培养。

1.2.2细菌药敏试验购自杭州滨河微生物试剂有限公司10种头孢类抗生素药敏纸片为头孢唑啉、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁和氨曲南。药敏试验采用常规纸片法进行。菌液制备：挑选普通营养琼脂平板上分离培养好的大肠杆菌菌落置于灭菌的0.9%氯化钠溶液中，制成均匀悬液，使其浊度与0.5麦氏单位比浊管浊度一致。用灭菌棉签蘸取制备好的菌液，均匀涂布整个平板表面。用灭菌镊子夹取药敏纸片1张，贴在平板表面，1块平板上贴4种不同的药敏纸片，各药敏纸片间间隔≥30mm，且纸片距平板边缘≥15mm。操作完成的平板放入恒温培养箱中37℃24h后，仔细观察，并测量各药敏纸片抑菌圈直径。结果判定参考《抗微生物药物敏感试验执行标准（CLSI-M100-S20）》。

1.2.3细菌超广谱β-内酰胺酶耐药基因检测

1.2.3.1细菌ESBLs耐药基因PCR扩增引物根据已发表文献的ESBLsTEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因序列，设计合成TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9上下游引物（表1）。

1.2.3.2细菌DNA模板制备及ESBLs耐药基因PCR检测取各仔猪腹泻大肠杆菌营养肉汤培养物1mL，4℃10000r/min离心3min，去除上清，加生理盐水1mL摇匀；再同上离心洗涤1次，弃上清液，取1mL生理盐水加入管中摇匀，作为细菌DNA模板。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；然后72℃延伸10min［3-6］。PCR基因片段检测：用1倍TBE缓冲液配备1.2%琼脂凝胶100mL，加入5μLGoldview倒板冷却后，取各PCR产物10μL加样后电泳。电泳仪设定电压120V、电流130mA、时间45min，电泳后采用紫外检测仪观察结果。

2结果与分析

2.1细菌复苏纯化培养结果与分析

在普通营养琼脂平板上分区划线接种34株仔猪腹泻大肠杆菌菌种冻干粉，37℃培养24h后，菌落均生长良好，呈圆形、湿润、无色半透明状菌落［4-6］（图1）。SS琼脂平板上生长出圆形、光滑的红色菌落［4-6］（图2）。营养肉汤中呈均匀、浑浊状态，底部出现黏性沉淀物，液面管壁出现菌环。

2.2细菌药敏试验结果与分析

由表2结合《抗微生物药物敏感试验执行标准（CLSI-M100-S20）》的判断标准可知，34株仔猪腹泻大肠杆菌对头孢唑啉、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢西叮、氨曲南10种抗生素的敏感度不同，其中，对头孢唑啉、头孢噻吩、头孢呋辛的耐药率比较高，分别为68%、65%和56%，敏感率比较低，分别为29%、15%和35%，这可能与临床使用上述3种抗生素较多有关；对头孢哌酮、氨曲南的耐药率比较低，分别为15%和9%，敏感率比较高，分别为70%和79%，这可能与临床使用上述2种抗生素较少有关。

2.3细菌耐药基因检测结果与分析

34株仔猪腹泻大肠杆菌菌株超广谱β-内酰胺酶TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9基因片段PCR检测结果表明，其中34株仔猪腹泻大肠杆菌均被检测到超广谱β-内酰胺酶TEM基因片段，7号菌株细菌被检测到CTX-M-9基因片段，其他基因片段未被检测到。

2.3.1TEM耐药基因检测结果与分析由图3、图4可知，34株仔猪腹泻大肠杆菌均检测到TEM耐药基因，该耐药基因检出率为100%。

2.3.2CTX-M-9耐药基因检测结果与分析

由图5、图6可知，34株仔猪腹泻大肠杆菌7号菌株被检测到CTX-M-9耐药基因，该耐药基因检出率为2.8%。

3讨论

头孢类抗生素是兽医临床抗细菌感染治疗中最常应用的抗生素，随着3代头孢类抗生素的大量应用，细菌对头孢类抗生素耐药现象越来越严重，细菌对此类药物耐药的很大一部分因素是产生β-内酰胺酶和ESBLs。TEM型耐药基因是ESBLs中最常见的基因型，至今已有168种，呈全球性分布，也是我國最常见的ESBLs［7］。本试验结果表明，34株仔猪腹泻大肠杆菌全部检测到TEM耐药基因，阳性率为100%；检测到1株CTX-M-9耐药基因，检测率为2.8%。Kawamura等报道，TEM可水解羧苄西林、苯唑西林或头孢菌素；SHV具有水解头孢噻肟巯基的功能；CTX-M对头孢噻肟水解作用很大，对头孢他啶水解作用很小［8］。根据本试验药敏试验和耐药基因检测结果可知，34株仔猪腹泻大肠杆菌对10种抗生素耐药性和敏感性情况差别较大，但检测出CTX-M-9耐药基因的7号菌株对头孢噻肟的耐药性明显比其他未检测出的菌株高。34株仔猪腹泻大肠杆菌全部检测到TEM耐药基因，说明该猪场仔猪腹泻致病性大肠杆菌对头孢类抗生素均已经产生耐药，应重视。由于检测的仔猪腹泻大肠杆菌菌株数较少，检测出的ESBLs基因类型也较少，仔猪腹泻大肠杆菌具体的耐药特性和ESBLs基因分布状况有待更进一步探索。

参考文献：

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［6］方光远，张莉，陆宇超，等.犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定和耐药性检测［J］.中国畜牧兽医，2014，41（9）：273-277.

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［8］KawamuraK，NaganoN，SuzukiM，etal.ESBL-producingEscherichiacolianditsrapidriseamonghealthypeople［J］.FoodSafety，2017，5（4）：122-150.