吴刚强，袁春云，毛 叶，陈 琪，温小凤，谭 军，卜献春，李 非

(1.湖南省中医药研究院附属医院老干科/全国名老中医药专家卜献春传承工作室,湖南 长沙 410006;2.湖南省中医药研究院附属医院药剂科,湖南 长沙 410006)

目前,糖尿病呈全球蔓延趋势,是造成世界范围内人类死亡和疾病负担的主要原因之一,已成为全球人类共同面对的一个重大健康问题。糖尿病心肌病是糖尿病的一种常见血管并发症,以心肌结构和功能异常为特征。目前,关于糖尿病心肌病的治疗涉及降糖、降脂、控制血压、改善心肌重构等,有效地控制血糖仍是治疗糖尿病心肌病的基本手段。然而,多种降糖药物存在一定的不良反应,如噻唑烷二酮类、二肽基肽酶-4抑制剂沙格列汀和阿格列汀均可增加心力衰竭住院风险[1-2]。近年来,关于糖尿病心肌病新的治疗手段不断涌现,但糖尿病心肌病的高发病率和高病死率仍然困扰着广大临床医务工作者;因此,仍需开发新的治疗糖尿病和糖尿病心肌病的药物。中医药治疗糖尿病疗效确切,具有毒副作用小、价格低廉、患者依从性好的优点。本课题组前期研究表明,应用益气养阴、活血通络的滋膵通脉饮治疗糖尿病心肌病可取得显著的疗效[3-4]。自噬可消除受损的蛋白质和细胞器,是维持细胞器功能和内环境稳定的关键生物过程。自噬的影响因素很多,包括高血糖、氧化应激、胰岛素抵抗等,这些影响因素可通过相关的信号通路导致心肌细胞损伤[5-6]。研究显示,自噬参与糖尿病心肌病的病理生理过程[7-9]。基于此,本研究通过观察滋膵通脉饮对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬和凋亡的影响,探讨滋膵通脉饮含药血浆对高糖诱导下心肌细胞的保护作用及机制,以期为滋膵通脉饮治疗糖尿病心肌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞20只无特定病原体级雄性Sprague Dawley大鼠购自湖南斯莱克景达公司,体质量 200～280(250±20)g,饲养于无特定病原体级动物房内,温度23 ℃,湿度60%,每12 h 交替照明,自由饮食、饮水。大鼠H9c2心肌细胞由长沙艾碧维生物科技有限公司提供。

1.2 药物、主要试剂与仪器滋膵通脉饮由湖南省中医药研究院附属医院门诊中药房提供,由黄芪、生地、麦冬、玄参、山茱萸、天花粉、地龙、生蒲黄、丹参、川芎、鬼箭羽、全蝎、水蛭、僵蚕、山楂等药物组成,药物质量浓度为4 400 g·L-1;恩格列净购自上海勃林格殷格翰药业有限公司(国药准字H20201008)。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8) 购自上海沪震有限公司,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)细胞毒性检测试剂盒购自上海源业生物科技有限公司,p62、微管相关蛋白 1 轻链 3( microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗及山羊抗小鼠 IgG二抗、辣根过氧化氢酶(horseradish peroxidase,HRP)标记山羊抗兔IgG二抗购自美国Proteintech公司,Beclin-1抗体购自北京博奥森生物科技有限公司,转膜缓冲液、10× 丽春红染液、脱脂奶粉、放射免疫沉淀裂解液、蛋白磷酸酶抑制剂、胰蛋白酶消化液、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)、细胞冻存液均购自中国长沙Abiowell公司,蛋白酶抑制剂购自北京金泰宏达公司,显影液、定影液购自上海佳信公司,达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Sigma公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco公司,双抗(青链霉素)购自上海碧云天生物技术有限公司,Rapamycin购自美国ApexBio公司;细胞培养瓶购自瑞士Nest公司,超净工作台购自北京亚泰隆公司,直热式CO2培养箱购自上海三藤仪器公司,倒置生物显微镜购自北京中显恒业仪器公司,低速离心机购自上海知信实验仪器技术有限公司,WD-9413A型凝胶成像分析系统购自北京六一生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 滋膵通脉饮含药血浆的制备按随机数字表法将20只SD大鼠分为空白血浆组和滋膵通脉饮组,每组10只。2组大鼠均按照临床70 kg成人剂量的5倍给药,滋膵通脉饮组大鼠每天给予10 mL·kg-1滋膵通脉饮灌胃,空白血浆组大鼠给予等剂量的灭菌超纯水灌胃,连续灌胃 7 d。末次灌胃1 h 后,予以100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉,然后采集腹主动脉血,乙二胺四乙酸二钠抗凝,3 000 r·min-1离心15 min分离血浆,0.22 μm 滤膜过滤,56 ℃恒温水浴锅中灭活30 min,然后分装至无菌EP管中,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 细胞培养将H9c2细胞接种于含体积分数10%FBS、体积分数1%双抗的DMEM中,置于37 ℃、含体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中,培养至细胞密度达80%左右,取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖情况取对数生长期H9c2细胞接种到96孔细胞培养板中,置于37 ℃、含体积分数5%CO2恒温培养箱中过夜,用预冷的培养液将细胞同步化处理,然后随机分为正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组,分别加入稀释后的胎牛血清、空白血浆组血浆及滋膵通脉饮组血浆,每组设置体积分数5%、10%、15%的浓度梯度;干预24 h后,吸弃上清,各孔中滴加10 μL CCK-8,继续置于37 ℃、含体积分数5%CO2恒温培养箱中培养2 h,然后检测各孔在450 nm处的吸光度值,以吸光度值表示细胞的增殖能力,吸光度值越高表示细胞增殖能力越强。实验重复3次,取均值。

1.3.4 细胞毒性比色法检测LDH释放率取对数生长期H9c2细胞铺板在96孔板中,待细胞贴壁后分为正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组。正常对照组细胞不加任何药物干预;高糖诱导组细胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和体积分数10%空白血浆组血浆;高糖诱导+中药含药血浆组细胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和体积分数10%滋膵通脉饮组血浆;高糖诱导+恩格列净组细胞加33.3 mmol·L-1D-葡萄糖和0.01 μmol·L-1恩格列净,继续培养 24 h;分别加入60 μL的LDH细胞毒性检测试剂,混匀,室温下使用水平摇床避光孵育30 min,应用酶标仪测定490 nm处吸光度(absorbance,A)值,计算LDH释放率,LDH释放率=[(实验组A值-总自然释放A值)/(最大释放组A值-总自然释放A值)]×100%。

1.3.5 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡情况取对数生长期H9c2细胞,按“1.3.4”项分组培养24 h后,用不含乙二胺四乙酸胰酶消化,收集细胞;PBS洗涤细胞2次,每次2 000 r·min-1离心5 min,收集约3.2×105个细胞;加入500 μL的Binding buffer 悬浮细胞,然后加入5 μL人膜联蛋白V(annexin V)-别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)混匀后,再加入5 μL 碘化丙啶(propidium iodide,PI)溶液,充分混匀,室温避光反应10 min;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次,取均值。

1.3.6 Western blot法检测H9c2细胞中p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bax蛋白表达取对数生长期H9c2细胞,按“1.3.4”项分组培养24 h后,用冰预冷PBS洗涤1次,加入200 μL 放射免疫沉淀裂解液冰上裂解10 min;4 ℃下12 000 r·min-1离心 15 min,取上清液1.5 mL,应用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度;取100 μL蛋白上清,加入25 μL 5×loading buffer混匀,沸水煮5 min,放入冰盒中速冷备用;应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,恒定电压75 V电泳130 min,然后转至硝酸纤维素膜;用脱脂奶粉封闭,室温放置90 min;滴加p62、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Bcl-2、Bax、GAPDH一抗(滴度均为15 000),4 ℃孵育过夜;然后,使用HRP 标记山羊抗小鼠 IgG二抗(滴度为15 000)或HRP 标记山羊抗兔IgG二抗(滴度为16 000)室温孵育90 min,用含吐温-20 的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution with tween-20,PBST)清洗3次,每次约15 min;使用增强型化学发光液显色;应用WD-9413A型凝胶系统成像,Image J 软件分析灰度值,以GAPDH为内参蛋白,目的蛋白相对表达量以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示。实验重复3次,取均值。

2 结果

2.1 正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖情况比较结果见表1。体积分数5%、15%浓度时,正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较差异有统计学意义(F=5.741、6.041,P<0.05);滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力显著低于正常对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组与空白对照组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。 10%浓度时,正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义(F=0.110,P>0.05),说明体积分数10%含药血浆对细胞增殖抑制的影响最小,故选用体积分数10%含药血浆作为含药血浆干预浓度。

表1 正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较 Tab.1 Comparison of proliferation ability of H9c2 cells among the normal control group,blank control group and Zicui Tongmai Yin group

2.2 正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率比较结果见图1。正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率分别为(2.63±0.29)%、(42.89±2.60)%、(14.35±0.27)%、(17.56±2.26)%。 正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率显著低于高糖诱导组,差异有统计学意义(t=43.527、23.836、21.617,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞凋亡率显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t= 14.933、11.723,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率比较差异无统计学意义(t=1.995,P>0.05)。

A:正常对照组;B:高糖诱导组;C:高糖诱导+中药含药血浆组;D:高糖诱导+恩格列净组。图1 正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡情况 Fig.1 Apoptosis of H9c2 cells in the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

2.3 常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH释放率比较正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH 释放率分别为(4.54±0.85)%、(44.33±1.72)%、(16.28±0.85)%、(18.71±2.20)%。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH 释放率显著低于高糖诱导组,差异有统计学意义(t=58.660、31.408、26.557,P<0.01);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞LDH 释放率显著高于正常对照组,差异有统计学意义(t=14.167、11.740,P<0.05);高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞LDH 释放率比较差异无统计学意义(t=1.801,P>0.05)。

2.4 正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞自噬和凋亡相关蛋白表达水平比较结果见图2和表2。正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中p62、Bax表达显著低于高糖诱导组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2显著高于高糖诱导组,差异有统计学意义(P<0.05);高糖诱导组H9c2细胞中Bcl-2/Bax显著低于正常对照组和高糖诱导+中药含药血浆组,差异有统计学意义(P<0.05);高糖诱导组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义(P>0.05);高糖诱导+恩格列净组和高糖诱导+中药含药血浆组H9c2细胞中p62、Bax显著高于正常对照组,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2/Bax显著低于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bcl-2表达水平及Bcl-2/ Bax比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A:正常对照组;B:高糖诱导组;C:高糖诱导+中药含药血浆组;D:高糖诱导+恩格列净组。图2 正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2蛋白表达Fig.2 Expressions of p62,Bax,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2 protein in H9c2 cells in the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

表2 正常对照组、高糖诱导组、高糖诱导+中药含药血浆组、高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中p62、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Bcl-2蛋白表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression levels of p62,Bax,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ and Bcl-2 protein in H9c2 cells among the normal control group,high-glucose induction group,high-glucose induction+traditional Chinese medicine containing plasma group and high-glucose induction+empagliflozin group

3 讨论

糖尿病是一种以慢性高血糖为特点的代谢性疾病,近年来其发病率呈现逐年上升趋势。糖尿病心肌病是糖尿病常见并发症,氧化应激、内质网应激、细胞外基质蛋白和晚期糖基化产物的堆积是糖尿病心肌病的早期特征。随着病情进一步发展,逐步出现左心室肥厚和收缩功能不全,最后导致心力衰竭。糖尿病心肌病常表现为心肌细胞的变性坏死、细胞凋亡,以及心肌细胞重建和心功能减退。目前,针对糖尿病心肌病治疗措施主要包括降糖、降脂、控制血压、改善心肌重构等,而有效地控制血糖是治疗的基本手段;然而,多种降糖药物存在一定的不良反应。中医药治疗糖尿病疗效确切,具有毒副作用小、价格低廉、患者依从性好等优点。滋膵饮出自于《医学衷中参西录》,原方由黄芪、生地、山药、山萸肉、生猪胰组成,用于治疗消渴。中药复方滋膵通脉饮为湖南省名中医卜献春教授在原方基础上加减而成,功效为益气养阴、活血通络。该方在临床应用了多年,疗效满意,得到了患者的一致好评。前期研究显示,该方不仅能改善糖脂代谢和氧化应激、抑制炎症反应、减轻胰岛素抵抗,而且还能改善糖尿病心肌病心肌纤维化,改善心肌重构[3-4,10-12];但具体机制有待进一步深入探讨。因此,本研究应用大鼠H9c2心肌细胞探讨中药复方滋膵通脉饮对糖尿病心肌病治疗的效果和机制。

本研究结果显示,5%、15%浓度时,滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力显著低于正常对照组、空白对照组;10%浓度时,正常对照组、空白对照组和滋膵通脉饮组H9c2细胞增殖能力比较差异无统计学意义,说明10%含药血浆对细胞增殖抑制的影响最小,故选用10%含药血浆作为含药血浆干预浓度。LDH是存在于细胞质的一种酶,当细胞膜受到损伤时,LDH即释放到细胞培养基中。因此检测培养基中LDH的量可以作为测定受损细胞数量的指标。本研究结果显示,高糖诱导组H9c2细胞凋亡率和LDH 释放率显著高于正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组,高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率和LDH 释放率显著高于正常对照组,高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞凋亡率和LDH 释放率比较差异无统计学意义;说明,高糖刺激下的H9c2心肌细胞凋亡率和LDH释放率明显上升,提示心肌细胞损伤;而滋膵通脉饮和恩格列净可抑制H9c2细胞凋亡和LDH 释放,减轻心肌细胞损伤,且滋膵通脉饮和恩格列净作用相当。

自噬是一种细胞内降解机制,通过吞噬受损的细胞器而形成自噬体,然后与溶酶体融合并降解其包裹的内容物,在应激条件下对于维持细胞内稳态有极其重要的作用[13]。自噬在维持心脏的结构、功能和心肌细胞完整性中发挥极其重要的作用。适度的自噬对心脏正常功能的维持尤其重要[14],但过度自噬可能引发心脏结构、功能和心肌细胞完整性的异常。研究显示,自噬紊乱与糖尿病心肌病的发生发展密切相关,恢复正常的自噬水平对糖尿病心肌病有明显的保护作用[15]。泛素连接蛋白 p62是反映自噬活性的蛋白,为自噬特异性降解底物,存在于多种细胞中,参与各种信号传导过程。当自噬被激活时,自噬体与溶酶体融合,溶酶体酶降解自噬囊泡中的p62,导致其水平下降;当自噬被抑制时可以导致自噬体堆积,使p62 水平升高,出现自噬障碍。研究显示,p62蛋白水平与自噬活性呈负相关关系,p62的积累在自噬障碍中起着重要的作用[16]。LC3是p62的受体,为自噬小体的标志蛋白,可作为自噬标志物;LC3有LC3-I 和 LC3-Ⅱ 2种形式,通常以 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值和p62表达水平来评价细胞自噬。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值越高,表示自噬活性越强[17]。本研究结果显示,高糖诱导组H9c2细胞中p62表达显著高于正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组,高糖诱导组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著低于正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组;高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平比较差异无统计学意义。这说明,高糖刺激可引起H9c2心肌细胞自噬相关蛋白p62显著升高和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显下降,提示H9c2心肌细胞自噬发生障碍并加重了心肌细胞损伤;恩格列净和滋膵通脉饮可通过抑制自噬相关蛋白p62和提高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平而抑制心肌细胞凋亡,进而减轻心肌细胞损伤。

Bax 是细胞凋亡的标志性蛋白,可导致细胞凋亡[18]。研究显示,Bax水平与糖尿病并发症关系密切[19]。正常情况下,抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax处于平衡状态,但在应激状态下,Bcl-2/Bax比值可发生转变。因此,Bcl-2/Bax比值可用来评估细胞凋亡水平[20]。本研究结果显示,高糖诱导组H9c2细胞中Bax表达显著高于正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组, Bcl-2及Bcl-2/Bax显著低于正常对照组、高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组;高糖诱导组与高糖诱导+恩格列净组H9c2细胞中Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义。高糖诱导+中药含药血浆组和高糖诱导+恩格列净组Bax显著低于正常对照,Bcl-2及Bcl-2/Bax显著高于正常对照组;高糖诱导+中药含药血浆组与高糖诱导+恩格列净组Bax、Bcl-2表达水平及Bcl-2/Bax比较差异无统计学意义。这一结果提示,高糖刺激可引起H9c2心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax明显下降,导致H9c2心肌细胞凋亡增加,从而引发H9c2心肌细胞损伤;恩格列净和滋膵通脉饮可通过抑制Bax和促进Bcl-2表达,抑制心肌细胞凋亡,进而减轻心肌细胞损伤。

综上所述,滋膵通脉饮可通过激活高糖诱导的大鼠H9c2心肌细胞自噬,抑制H9c2细胞凋亡,从而减轻心肌细胞损伤,其机制可能与调节相关信号通路有关,具体有待进一步研究。