谢荣荣 史婷婷 信 中 曹 曦 杨金奎,*

(1. 北京市糖尿病研究所/北京市糖尿病防治办公室,北京 100730; 2. 首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科,北京 102600)

Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy, GO)是一种器官特异性自身免疫疾病,发病率居成年人眼眶病的首位。其病理生理机制是眼眶组织糖胺聚糖的堆积导致球后结缔组织增生及眼外肌水肿,从而引起眼球突出、复视、斜视及视神经受压等临床表现[1-2]。根据疾病活动性可将GO分为活动期及非活动期。在活动期,病理表现为淋巴细胞浸润及成纤维细胞的活化; 非活动期,病理表现为眼外肌纤维化[3]。根据疾病的活动性,临床医生采取不同的治疗措施。目前临床上活动性评价受到患者自身和医师工作经验等主观性因素的影响,因此寻找合适的客观性生物标志物评价GO的活动性尤为重要。

细胞因子是机体免疫应答过程中细胞分泌的具有广泛生物学活性的异质性调节因子[4]。目前,细胞因子分为五类:干扰素群系(interferons, IFNs)、白细胞介素群系(interleukins, ILs)、克隆刺激因子群系(colony-stimulating factors,CSFs)、转化因子群系(transforming growth factors, TGFs)和肿瘤坏死因子群系(tumor necrosis factors, TNFs)[5-6]。研究[4]表明,细胞因子在GO的发生发展中发挥重要的作用。本研究通过检测活动期及非活动期GO患者血浆中的12项细胞因子[包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α]浓度,分析这些因子与疾病活动度等指标的相关性,为GO的治疗提供新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2021年1月至2023年1月在首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科门诊就诊的GO患者27例。GO患者入组标准:①结合临床症状、实验室检查及影像学检查,所有患者均按照Bartley标准诊断明确;②所有患者均应用甲巯咪唑片(德国默克公司,国药准字J20171078,规格10 mg/片)治疗;③所有患者均未接受过眼部疾病治疗,包括糖皮质激素、免疫抑制剂、放射治疗及手术治疗;④18岁≤年龄<70岁;⑤神志清楚,配合随访。GO排除标准:①甲状腺功能异常者;②既往对抗甲状腺药物过敏,有放射性碘或甲状腺手术治疗史;③1个月前抗生素及免疫抑制剂或激素类药物使用史;④合并其他自身免疫性疾病;⑤妊娠期或哺乳期女性;⑥合并其他严重原发性疾病,包括糖尿病、高血压、高血脂等;合并恶性肿瘤以及酒精及其他药物依赖史,伴有精神障碍及认知障碍。根据临床活动性评分(Clinical Activity Score,CAS)及美国甲状腺学会颁布的分级标准(0: no signs or symptoms;1:only signs, no symptoms;2:soft tissue involvement;3:proptosis;4:expraocular muscle involvement;5:cornea involvement;6:sightloss, NOSPECS)对患者进行疾病活动期分期,将其中CAS≥3分的14例患者为活动期组(病例组),CAS<3分的13例患者为非活动期组(对照组)。研究方案符合人体试验伦理学标准,并得到首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会的批准(批准号TRECKY2016-003);所有纳入本研究的患者均签署了知情同意书。

1.2 资料收集

内容包括性别、年龄、吸烟史、肝肾功能、甲状腺功能检查、甲状腺自身抗体及患者用药史。

1.3 实验室检测

1.3.1 血清甲状腺激素测定

血清甲状腺激素[游离三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、四碘甲腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)]和促甲状腺激素 (thyroid stimulating hormone,TSH)的检测在 ADVIA Centaur XP Immunoassay系统平台中进行(西门子公司,德国)。促甲状腺素受体抗体(thyrotropin receptor antibody,TRAb)滴度的测定采用电化学发光法(Roche公司, 德国)。参考范围(FT3:3.50～6.50 pmol/L,FT4:11.50～22.70 pmol/L,T3: 0.92～2.97 nmol/L,T4:57.9～140.3 nmol/L,TSH:0.55～4.78 μIU/mL,TRAb: 0.00～1.75 IU/L)。

1.3.2 血浆细胞因子的测定

应用乙二胺四乙酸二钾(ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt, EDTA-K2)抗凝采血管采集两组患者的清晨空腹静脉血标本。1 000g离心10 min, 取分离出的血浆进行细胞因子检测。全血充分混匀后在全自动血液分析仪上机,采用细胞因子检测试剂盒(CytoFLEX:贝克曼库尔特公司,美国)、多重微球流式免疫荧光发光法检测12种血浆细胞因子(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-12P70、IFN-α、IFN-γ、TNF-α)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者基本临床特征比较

本研究对14例活动期及13例非活动期GO患者的临床资料进行了对比分析,结果显示,两组患者在年龄、性别、肾功能(尿素氮及肌酐)、肝功能(丙氨酸氨基转移酶及门冬氨酸氨基转移酶)及甲状腺功能水平方面,差异均无统计学意义(P>0.05)。活动期GO组患者的TRAb浓度明显高于非活动期组患者,差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 活动期及非活动期GO患者的一般临床特征比较Tab.1 Baseline characteristics of patients with inactive and active GO

2.2 活动期与非活动期GO患者9种血浆白细胞介素浓度比较

两组患者血浆9种白细胞介素浓度比较结果显示,与非活动期相比,活动期患者的血浆IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17浓度明显升高,组间差异均有统计学意义(P<0.05),其余3种白细胞介素(IL-2、IL-6及IL-12P70)浓度组间差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

图1 活动期与非活动期GO患者血浆白细胞介素浓度Fig.1 Levels of interleukins in active and inactive GO patients

2.3 活动期与非活动期GO患者3种细胞因子浓度比较

两组患者的血浆IFN-α、IFN-γ及TNF-α比较结果显示,与非活动期相比,活动期患者的TNF-α及IFN-γ浓度显著升高,组间差异均有统计学意义(P<0.05),而两组患者血浆 IFN-α浓度差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 活动期与非活动期GO患者血浆TNF-α、IFN-α、IFN-γ浓度Fig.2 Levels of TNF-α, IFN-α and IFN-γ in active and inactive GO patients

2.4 血浆细胞因子与GO患者CAS评分的相关性分析

血浆细胞因子与CAS评分相关性分析结果表明,IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ及TNF-α与CAS评分呈现显著正相关(P<0.05)(表2)。

表2 血浆细胞因子与GO患者CAS评分的相关性Tab.2 Correlation between cytokines and CAS scores in patients with GO

2.5 活动期的单因素Logistic回归分析

考虑到样本量较小,对活动期与非活动期组间显著的指标,包括TRAb、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10和IL-17进行单因素Logistic回归分析。结果显示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高会增加活动期风险(表3)。

表3 活动期的单因素Logistic回归分析Tab.3 Single factor Logistic regression analysis

3 讨论

GO是一种可威胁视力的自身免疫性疾病,临床表现为眼球突出、复视或斜视,严重者可能会有视神经受压及角膜溃疡,甚至导致失明。在临床工作中,内分泌医师根据疾病的活动性,采取不同的治疗措施:如GO处于活动期阶段,患者可能接受糖皮质激素或免疫抑制剂等治疗抑制免疫反应;在疾病非活动期,医生将更多选择矫正手术等改善患者的斜视及复视。目前临床上活动性评价受到患者自身和医师工作经验等主观性因素的影响,因此寻找合适的客观性生物标志物来评价GO的活动性尤为重要。细胞因子在机体免疫调节及宿主防御等机制中扮演重要角色,例如IL-6广泛表达于单核/巨噬细胞、淋巴细胞、内皮细胞及成纤维细胞中[7-8],IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及IL-17主要由淋巴细胞分泌[9-10],IL-1β、IL-8及IL-12主要由单核/巨噬细胞分泌[11],IFN-α及IFN-γ作为IFN家族成员代表由淋巴细胞及巨噬细胞等分泌[12-13]。是否能够找到与GO活动度密切相关的细胞因子是本文研究目的。在本文研究中,纳入了初始治疗的活动期及非活动期GO患者,这两组患者在甲状腺功能上无明显差异。本研究结果显示,活动期GO患者的IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17浓度明显高于非活动期组,TNF-α及IFN-γ浓度明显升高,两组浓度差异均有统计学意义,预示这8种细胞因子可能是GO相关细胞因子。进一步单因素Logistic回归分析结果显示IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高会增加活动期风险, 提示该四种因子有可能作为评判GO活动性的指标。

在GO患者中白细胞介素的浓度变化方面,Kishazi等[14]发现GO患者中IL-10、IL-12P70、IL-13、IL-6和TNF-α浓度明显高于健康受试者, 而活动期GO患者中的IL-13、IL-6和TNF-α浓度显著升高;Song等[15]发现,GO患者泪液中IL-12P70、IL-1β、IL-2、IL-21及IL-6等13种蛋白浓度显著升高,而白介素1可溶性受体Ⅰ及IL-13等蛋白浓度下调。本文研究发现,在上调的细胞因子中,IL-17浓度在活动期及非活动组中差异最为明显,并且与临床活动度评分具有正相关性。IL-17因子是由分化决定族抗原4(cluster of differentiation 4,CD4) T细胞亚群中辅助性T 细胞17(T helper cell 17, Th17)细胞分泌,目前已经证明可能在自体免疫疾病的发生发展中发挥着着重要角色[16]。IL-17作为促炎症因子可诱导靶细胞产生趋化因子和增加集落刺激因子[17]。研究[18-19]表明,血清中IL-17浓度在自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎)中高表达,而且血清中IL-17滴度与病情严重程度具有正相关性。研究[20-21]表明,活动期GO患者进行糖皮质激素治疗伴随IL-17浓度的显著下降,这提示IL-17在GO发病及转归中的重要作用,可作为评价GO病情活动度的指标之一。

综上所述,活动期GO患者血浆中IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10及IL-17浓度明显高于非活动期组, 其中IL-1、IL-4、IL-5和IL-17升高会增加活动期风险。但在本项研究中,课题组未对GO患者治疗前后的细胞因子浓度进行研究,无法明确治疗过程中临床活动度的变化与细胞因子的关联性。并且此研究样本量小,缺乏长期随访跟踪研究,未能排除药物对细胞因子的影响,在后续的研究中需要扩大样本量,对GO患者治疗前后的细胞因子进行分析,并设置治疗后不同疗效组,分析不同治疗方案的治疗效果与细胞因子的相关性,进一步探讨细胞因子与GO的关系。鉴于此,分析不同的细胞因子在GO患者中的表达情况及其对GO的影响可为GO的临床治疗提供新的思路及免疫治疗新的靶点,以便寻找新的安全有效的治疗方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明谢荣荣:提出研究思路,设计研究方案,数据分析,撰写论文;史婷婷,信中: 采集数据;曹曦:分析数据;杨金奎:审定论文,总体把关。