习媛,刘玉崟,廖超,张娜,贺心宁,田理

成都中医药大学附属医院,四川 成都 610075

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是特应性个体暴露于过敏原后由免疫球蛋白 E(immunogloblin E,IgE)介导的鼻黏膜非感染性慢性炎症性疾病,主要症状为打喷嚏、鼻塞和鼻痒、流清涕等。在过去几十年中,AR的发病率显著升高[1],全世界有10%～20%人口深受其困扰[2],目前,AR采用糖皮质激素、过敏反应介质阻断剂、免疫调节剂等药物治疗为主,但患者会出现一些不良反应[2-3]。近年来,中医药防治 AR已逐渐被认可,其可通过多靶点、多机制发挥作用,具有控制症状、预防复发、身心调护等优势[4-5]。四川省名中医田理主任医师在20余年AR诊疗中凝练出AR的核心病因病机是肺卫亏虚、虚邪贼风外袭、正邪搏结、血瘀鼻窍、腠理不固,研发出玉屏风加味鼻喷剂,具有益气固表、活血通窍等作用,并在前期研究中筛选出最佳药效浓度(1.05 g·mL-1)[6],现阶段基于临证经验运用玉屏风加味鼻喷剂每日2次治疗AR,临床反馈疗效确切[7-9],但尚缺少频次及给药时间相关的实验研究。本研究建立了变应性鼻炎大鼠模型,考察不同用药频率下玉屏风加味鼻喷剂对AR大鼠的影响,以期为确定临床最优用药方案提供实验依据。

1 材料

1.1 动物SPF级6～7周龄SD雄性大鼠60只,体质量160～190 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号SCXK(京)019-0008,饲养于光线良好,通风,温度、湿度适宜的实验室,大鼠自由饮水,普通饲料喂养。本实验经成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审核通过,伦理审查编号:2022DL-010。

1.2 药物与试剂糠酸莫米松鼻喷剂(美国默沙东公司,货号:U025821);卵清蛋白、氢氧化铝粉末[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,货号:M0228A、MKCM1237];大鼠分泌型免疫球蛋白(secretory immunoglobulins A,sIgA)、IgE ELISA 检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号:E-EL-R0875C、E-EL-R0517C);苏木素染液(上海懿洋仪器有限公司,批号:201901,harris方法配置);伊红染液(成都科隆化学品有限公司,批号:2021012501,配置成0.25%水溶液)。

1.3 仪器Minista型低温离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司);DNM9602G型酶标仪(成都普朗医疗设备有限公司);TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-III型包埋机(常州中威电子仪器厂);RM2235型轮转式切片机(德国LEICA公司);CX31型光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)。

2 方法

2.1 药物制备玉屏风加味鼻喷剂由成都中医药大学药剂科根据已有玉屏风加味鼻喷剂制剂工艺[10]制备,方剂组成为蜜炙黄芪30 g,生白术15 g,防风10 g,酒川芎10 g,牡丹皮10 g,煎煮浓缩配至浓度 1.05 g·mL-1,每支10 mL。

2.2 大鼠模型制备及分组给药大鼠适应性喂养3 d后,参考文献所述[11]制备变应性大鼠模型,具体如下:将0.3 mg OVA和30 mg Al(OH)3溶于1 mL生理盐水中形成混悬液给予大鼠腹腔注射致敏,隔日1次,共7次。第15天开始,每只大鼠以50 μL 2% OVA溶液滴鼻局部激发,每日1次,共7次。造模结束30 min后参照参考文献[12]对大鼠进行行为学评分,具体标准见表1,叠加评分≥5分造模成功。大鼠造模成功后按照随机数字法分为模型组、玉屏风加味鼻喷剂低频次组、玉屏风加味鼻喷剂中频次组、玉屏风加味鼻喷剂高频次组及糠酸莫米松组,每组10只。另设正常组10只。玉屏风加味鼻喷剂低、中、高频次组大鼠每日分别给予该药物1次、2次、3次滴鼻,每侧50 μL,每次用药间隔不少于4 h。糠酸莫米松组给予糠酸莫米松鼻喷剂滴鼻,每侧 50 μL,每日1次。正常组及模型组以生理盐水滴鼻,每侧50 μL,每日1次,连续干预4周。

2.3 大鼠行为学评分造模结束后及治疗1周、2周、4周时,在滴鼻给药结束30 min后,参照表1,观察各组大鼠5 min内的行为对大鼠进行行为学评分,从大鼠打喷嚏、抓鼻及清涕3个方面进行评价,叠加法记录总分值,用于判定造模情况和治疗情况。

表1 大鼠行为学量化评分标准

2.4 大鼠血清IgE水平检测各组大鼠分别在给药1周、2周、4周后给予体积分数2%戊巴比妥钠麻醉,取1.5 mL左右眼眶静脉血,离心后取血清,参照大鼠ELISA 试剂盒说明书检测血清中IgE的水平。

2.5 大鼠鼻咽冲洗液中sIgA水平检测末次治疗结束后禁食不禁水12 h,大鼠麻醉后取仰卧位于手术板上,用移液器吸取500 μL生理盐水冲洗鼻腔,冲洗3次,收集鼻、咽流出的冲洗液,不少于1 mL,即为鼻咽冲洗液,离心后取上清,按照大鼠slgA ELISA 试剂盒说明书步骤检测sIgA水平。

2.6 大鼠鼻黏膜病理变化分别于大鼠给药2周、4周时,从各组大鼠中随机抽取3只进行麻醉,处死后取鼻黏膜,置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定 48 h,脱水,包埋,切片(厚度3 μm),进行HE 染色,光镜下观察鼻黏膜病理改变,任选10个200倍视野观察黏膜上皮层、固有层、基底膜和黏膜下层的病理状况,并根据文献标准[13]计分量化,见表2。

表2 大鼠鼻黏膜病理量化评分标准

3 结果

3.1 玉屏风加味鼻喷剂对大鼠行为学的影响与正常组比较,模型组行为学评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,给药1周时,玉屏风加味鼻喷剂中、高频次组行为学评分降低;给药2周、4周时,玉屏风加味鼻喷剂各频次组及糠酸莫米松组大鼠行为学评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与玉屏风加味鼻喷剂低频次组比较,给药1周时玉屏风加味鼻喷剂中、高频次组大鼠行为学评分降低;给药2周、4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组及糠酸莫米松组大鼠行为学评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与给药1周时比较,给药2周、4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组及糠酸莫米松组大鼠行为学评分降低;与给药2周时比较,给药4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组及糠酸莫米松组大鼠行为学评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠行为学评分比较 分)

3.2 玉屏风加味鼻喷剂对大鼠血清IgE的影响与正常组比较,模型组大鼠血清IgE水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,给药1周、2周时,玉屏风加味鼻喷剂各组及糠酸莫米松组大鼠血清IgE水平下降;给药4周时,玉屏风加味鼻喷剂中、低频次组及糠酸莫米松组大鼠血清IgE水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与玉屏风加味鼻喷剂低频次组比较,在给药2周、4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组及糠酸莫米松组大鼠血清IgE水平下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与给药1周时比较,给药4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组及糠酸莫米松组大鼠血清IgE水平下降;与给药2周比较,给药4周时玉屏风加味中频次组大鼠血清IgE水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 大鼠血清IgE水平的比较

3.3 玉屏风加味鼻喷剂对大鼠鼻黏膜组织形态学的影响正常组大鼠鼻黏膜表面被覆移行上皮、假复层柱状上皮,细胞排列均匀、形态正常。模型组大鼠鼻黏膜组织结构紊乱,间质水肿,上皮大面积脱落化生,大量炎性细胞浸润,血管扩张明显。给药2周时,与模型组比较,玉屏风加味鼻喷剂中、高频次组及糠酸莫米松组大鼠鼻黏膜炎性浸润减轻,上皮层可见明显的再生微绒毛,玉屏风加味鼻喷剂低频次组大鼠鼻黏膜病理改变未见明显改善。给药4周时,玉屏风加味鼻喷剂低频次组较2周前大鼠鼻黏膜炎性浸润有所减轻、上皮层结构恢复;玉屏风加味鼻喷剂中频次组可见大鼠鼻黏膜结构与正常组无明显差异,间质无水肿,黏膜上皮完整性进一步修复,纤毛上皮未见明显脱落,纤毛排列整齐,方向一致;玉屏风加味鼻喷剂高频次组及糠酸莫米松组鼻黏膜可见假复层柱状上皮,纤毛形态基本正常且部分脱落,腺体增生。

评分数据分析显示,与正常组比较,模型组大鼠鼻黏膜病理计分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,给药2周及4周时,玉屏风加味鼻喷剂各组及糠酸莫米松组大鼠鼻黏膜病理计分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与玉屏风加味鼻喷剂低频次比较,给药2周时玉屏风加味鼻喷剂中、高频次组及糠酸莫米松组大鼠鼻黏膜病理计分下降;而在给药4周时,玉屏风加味鼻喷剂中频次组大鼠鼻黏膜病理计分下降,玉屏风加味鼻喷剂高频次组大鼠鼻黏膜病理评分上升,差异有统计学意义(P<0.05)。与给药2周时比较,在给药4周时玉屏风加味鼻喷剂中频次组大鼠鼻黏膜病理评分下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2及表5。

注:A:正常组;B:模型组;C:玉屏风加味鼻喷剂低频次组;D:玉屏风加味鼻喷剂中频次组;E:玉屏风加味鼻喷剂高频次组;F:糠酸莫米松组图1 给药2周后各组鼻黏膜HE染色情况(×400)

注:A:正常组;B:模型组;C:玉屏风加味鼻喷剂低频次组;D:玉屏风加味鼻喷剂中频次组;E:玉屏风加味鼻喷剂高频次组;F:糠酸莫米松组图2 给药4周后各组鼻黏膜HE染色情况(×200)

表5 各组大鼠鼻黏膜病理计分比较 分)

3.4 玉屏风加味鼻喷剂对大鼠鼻咽冲洗液sIgA的影响与正常组比较,模型组鼻咽冲洗液slgA水平下降;与模型组比较,玉屏风加味鼻喷剂各组及糠酸莫米松鼻咽冲洗液slgA水平升高;与玉屏风加味鼻喷剂低频次组比较,玉屏风加味鼻喷剂中、高频次组鼻咽冲洗液slgA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 大鼠鼻咽冲洗液sIgA水平的比较

4 讨论

AR 在中医学中称作“鼻鼽”,因肺气虚,卫气不足,鼻部腠理疏松,外邪或疠气乘虚而入,正邪相争而发病。玉屏风加味是以具有“强健肺卫、益气固表”功能的玉屏风散化裁而成。玉屏风散已广泛用于 AR 临床治疗,疗效显著,还具有不良反应少和复发率低、增强免疫的优势[14-15]。方中黄芪补气升阳以固表,白术健脾胃、温分肉,防风驱风解表,川芎行气祛风又可活血,丹皮破积血而生新血。鼻为多气多血之官,既是肺系之气升降出入之门户,又为营血循行之枢纽,将此五味药合用,煎煮浓缩后直接喷于鼻黏膜表面更快的发挥强健腠理、祛邪益气、活血通窍之效。

在AR发病中,鼻黏膜是接触变应原的首要部位,更是抵御变应原的第一道屏障。大量研究发现,尘螨、花粉、PM2.5等变应原及环境污染物会降解紧密连接蛋白或诱导鼻黏膜上皮细胞损伤[16-18],随后激活细胞信号传导、转录和诱导炎症介质释放[19-20],形成一个病理损伤-炎症反应-损伤加重的恶性循环,从而诱发及加重AR病情。同时,鼻黏膜还协同黏膜固有免疫细胞通过分泌黏液和免疫因子发挥黏膜免疫的作用[16]。AR作为一种免疫性疾病,黏膜免疫在AR中的作用在近年来日益受到重视。黏膜组织中最主要的免疫球蛋白sIgA是黏膜免疫系统的主要效应分子,存在于机体的多种分泌物中[21]。当机体呼吸道发生免疫应答时,上下呼吸道黏膜可同时产生大量sIgA以抵御病原体及有害物质入侵,维持黏膜稳态[22-23]。sIgA缺乏会使呼吸道黏膜免疫反应中存在免疫缺陷,导致sIgA低下人群更易发生慢性或反复感染、自身免疫疾病等[24]。因此,鼻黏膜损伤及黏膜免疫低下可能是AR 反复发作的重要原因。

此次实验中,模型组大鼠行为学积分>5分,鼻黏膜炎性浸润明显、结构紊乱、间质水肿、纤毛脱落,可判断AR大鼠模型建立成功。在分别给予AR大鼠每日1次、每日2次、每日3次玉屏风加味鼻喷剂滴鼻后,玉屏风加味鼻喷剂中频次组大鼠鼻部症状明显缓解,说明玉屏风加味鼻喷剂可有效改善AR大鼠鼻部症状。与模型组比较,玉屏风加味鼻喷剂中频次组在给药2周后大鼠鼻黏膜炎症浸润改善,尤其是鼻上皮纤毛系统得以修复,4周后鼻上皮完整性明显好转,纤毛排列整齐,方向一致,鼻黏膜结构与正常组比较无明显差异,提示玉屏风加味鼻喷剂具有修复鼻黏膜损伤,恢复鼻上皮纤毛系统功能的作用。同时玉屏风加味鼻喷剂可以明显提高AR大鼠鼻咽部冲洗液sIgA的含量,可见玉屏风加味还具有提高黏膜免疫的作用。

此外,AR作为最常见的非感染性鼻炎,其是由IgE介导的变态反应性疾病[25-26]。当鼻黏膜接触过敏原时,首先诱导局部产生特异性IgE,与鼻黏膜的肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和力IgE受体结合,IgE生物活性大大增强从而致敏。再次接触过敏原时,肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE与过敏原结合活化后释放组胺、白三烯等炎症介质,刺激鼻黏膜上的感觉神经末梢和血管,导致鼻痒、打喷嚏、流涕等症状[2]。研究发现,AR患者临床症状轻重程度与血清IgE含量密切相关[27],临床中检测AR患者血清IgE 的水平对明确 IgE 在AR病程中具体作用也具有重要意义[28],抗IgE也可有效改善症状并减少季节性和常年性过敏性鼻炎患者额外给药的必要性[29]。本实验中AR大鼠在玉屏风加味鼻喷剂干预后均有不同程度的血清IgE下降,其中中频次组更为显著,这提示玉屏风加味鼻喷剂通过降低IgE的水平阻止炎症细胞的活化和炎症介质的释放,从而减轻AR大鼠的症状,验证了玉屏风加味鼻喷剂的临床疗效,但其具体机制需进一步探讨。后期拟从明确主要有效成分、挖掘其修复鼻黏膜损伤及强化呼吸道黏膜免疫功能的分子作用机制等方面深入研究。

比较不同时间点下的低、中、高频次实验结果后发现,中频次组更为显著降低大鼠血清IgE水平、改善大鼠鼻黏膜损伤,并且也可显著提高大鼠鼻黏膜 sIgA的含量,因此可初步确定“每日2次”为玉屏风加味鼻喷剂最佳使用频次,推测其原因为“每日2次”滴鼻可使药物维持在一定的血药浓度范围,具体机制尚待进一步深入研究。本研究为玉屏风加味鼻喷剂治疗变应性鼻炎及确定临床最优给药方案提供了科学依据。

综上,玉屏风加味鼻喷剂通过修复鼻黏膜损伤、提高黏膜免疫、抑制AR免疫反应等改善AR,有望成一种重要的AR治疗外用药物。