陈紫玉,高文科,李明海,何弟南,龙艺丹,黄 蕾,王梓然

(云南农业大学园林园艺学院,昆明 650201)

【研究意义】无花果(FicuscaricaL.)是世界上最古老、栽培最早的果树之一[1]。据统计,无花果共有1000多个品种,以营养繁殖为主。作为高原特色水果,无花果富含多种营养物质及矿质元素,是矿物质[2]、甾醇[3]、类胡萝卜素[4]、花青素和多酚[5]较好的来源,具有广阔的发展前景。无花果味道甘甜、营养价值丰富,深受广大消费者的喜欢。近年来,与蓝莓等水果共同成为发达国家新兴的“超级水果”。果实色泽作为重要的外观品质,在一定程度上决定其商品价值。无花果果实色泽多样,成熟时呈黄色、黄绿色、绿色、红色或深紫色等颜色。就育种前景而言,无花果紫皮品种相比青皮品种,具有外观品质好、保健价值高、商品价值高等优势,是目前无花果育种的主要方向。因此,对调控果实颜色的基因进行功能性研究对于选育不同皮色的无花果品种具有重要意义。【前人研究进展】现在关于花青素的生物合成途径已有详细研究,尤其是在玉米、拟南芥、金鱼草和矮牵牛等模式作物中[6]。这些研究揭示了某些结构基因如查尔酮合酶(Chalcone synthase, CHS)、花青素合酶(Anthocyanin synthase, ANS)和黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose:flavonoid-3-O-glucosyltransferase, UFGT)[7]以及转录因子如MYB、bHLH、WD40等的重要性[8]。花色苷合成结构基因的表达受多种转录因子(TFs)调控,根据TFs所含保守结构域的不同,大致分为MYB、bHLH、WD40、MADS box和bZIP家族,其中研究最多的是MYB家族[9]。MYB是最具特征的转录因子家族之一,广泛分布于动物、植物和真菌中。基于MYB重复的数目,可将MYB蛋白分为4类:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[10]。目前花色苷生物合成调控的研究主要集中在MYB家族中的R2R3-MYB转录因子。2009年Espley等[11]在苹果中发现受光照诱导的促花色苷合成基因MdMYB1,随后又发现两类调控果肉花青苷生物合成的基因MdMYB10和MdMYB110a[12]。随着苹果中花色苷关键转录因子MdMYB1和MdMYB10的分离与功能验证,其同源基因在草莓、桃、梨、甜樱桃和石榴等植物中相继被分离出来[13]。R2R3-MYB调控可分为激活和抑制两类,如草莓中的FaMYB1[14]、拟南芥中的AtMYBL2[15]和葡萄中的VvMYBC等会抑制花色苷的合成[16]。病毒介导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)作为一种验证基因功能的方法在园艺作物上得到广泛的应用[17],包括矮牵牛[18]、月季[19]和番茄[20]等。【本研究切入点】利用VIGS 技术建立无花果基因沉默的技术体系,完善无花果的遗传转化体系。【拟解决的关键问题】本研究利用同源克隆技术对无花果果皮类黄酮生物合成调控基因FcMYB114的保守域进行克隆,利用TRV2 载体构建 VIGS 沉默体系,旨在探索无花果类黄酮生物合成途径中相关转录因子的分子调控机理,为创制不同色泽的无花果奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以栽种于云南省昆明市盘龙区云南农业大学滇台中心的普通型无花果品种‘紫宝’为试验材料,其2年生,自然开心形树形,树势中庸,东西走向。随机采取30个III期的果实,每10个为1个生物学重复,用装有生物冰的保温箱保存,迅速带回实验室。用手术刀片将果皮与雌花剥离,果皮厚度为2 mm,雌花重量为10 g,经液氮分别冷冻后,存于-80 ℃冰箱,用于基因组DNA的提取和VIGS试验。

1.2 试验方法

1.2.1 VIGS技术载体构建 TRV1和TRV2都具有Kan抗性。TRV1包含病毒在植物体内复制酶基因引发沉默机制;TRV2包含病毒蛋白质外壳、35S启动子和限制性酶切位点,用于插入基因片段,构建重组质粒。构建方法:将含有FcMYB114基因T1质粒及TRV2质粒的大肠杆菌DH5α菌液置于冰上融化,取10 μL菌液于10 mL离心管中,加入3 mL含有Kan 100 mg/L的液体LB培养基,将离心管置于摇床中,37 ℃,180 r/min,过夜培养;分别取200 μL活化好的各菌液于10 mL离心管中,加入5 mL含有Kan 100 mg/L 的液体LB培养基,置于摇床中,37 ℃,180 r/min,过夜培养;使用Axgen高纯度质粒小量提取试剂盒提取各原始质粒,其方法参照试剂盒说明书,将提取的质粒存于-20 ℃冰箱。提取的基因原始质粒用作后续 PCR 扩增模板,TRV2 质粒用于构建基因重组载体。在FcMYB114基因上下游引物两端分别加上限制酶XbaI、XhoI的酶切位点、保护碱基,直接用扩增片段进行双酶切反应,引物序列为:FcMYB114-F (5’-GCTCTAGAATGCAAAGCATA AACTGTGTTG),FcMYB114-R (5’-CCGCTCGAGTTAC CTGTTGCCTAAAAGCTTG)。

1.2.2 VIGS技术基因片段扩增 以原始T1质粒为模板,使用擎科Q5®Fast PCR Kit,分别克隆用于VIGS 载体构建的基因片段。采用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离,用刀片将含有目的DNA的琼脂糖凝胶切下,尽量切除含目的条带的凝胶。使用Axgen脂糖电泳胶回收试剂盒进行胶回收,获得的基因片段用于后续双酶切试验。

50 μL VIGS技术基因片段PCR扩增体系:10 μL 5×Buffer;2.5 μL dNTP Enhancer Buffer;2 μL PrimerFcMYB114-F(10 μmol/L);2 μL PrimerFcMYB114-R(10 μmol/L);1 μL cDNA;1 μL Pfu (1 U/μL);31.5 μL ddH2O。反应程序:95 ℃ 3 min(1个循环); 95 ℃ 2 min,60 ℃ 10 s,67 ℃ 20 s(35个循环);68 ℃ 5 min(1个循环)。

1.2.3 双酶切反应 用Axgen®PCR产物回收试剂盒回收各基因扩增片段,并对回收产物和 TRV2 质粒进行双酶切反应。在200 μL离心管中分别配制20 μL各基因片段的双酶切体系和50 μL TRV2质粒双酶切体系,37 ℃水浴,过夜反应12 h。将反应产物进行1%琼脂糖电泳处理,对目的基因片段条带和载体条带进行回收。双酶切反应体系:5 μL 5×Buffer;20 μLFcMYB114-PCR产物/质粒;2 μLXbaI;2 μLXhoI;21 μL ddH2O。目的片段和目的载体的连接:4 μL 5×Buffer、5 μL质粒、5 μL基因片段、6 μL ddH2O。

1.2.4 转化大肠杆菌以及载体测序分析 ①将双酶切反应产物采用热激法转化大肠杆菌;②挑取LB平板上的单菌落进行摇菌,作为待测菌液;③利用菌液PCR进行菌落鉴定;④根据检测结果,选取2～3个阳性克隆送至擎科生物技术有限公司进行测序;⑤利用DNAMAN等软件分析测序结果;⑥将测序正确的质粒根据Axgen质粒小量提取试剂盒的说明书进行提取,将重组载体转化农杆菌GV3101感受态细胞。

1.2.5 盐酸-甲醇法提取花青素 取0.5 g无花果果皮加液氮研磨成细粉后转入10 mL离心管中,加入5 mL含有0.1%盐酸的甲醇溶液,超声处理1 h后置于室内进行避光,震荡(120 r/min)过夜。室温下2500 r/min 离心10 min,取1 mL上清液与1 mL ddH2O、1 mL氯仿混合,离心(2500 r/min)10 min。用紫外分光光度计测定530 nm处上清液的吸光值,根据标准曲线计算花青苷的含量。

2 结果与分析

2.1 FcMYB114的筛选与进化树分析

通过云南农业大学园林园艺学院果树生理与品质实验室前期完成的‘青皮’与‘紫宝’转录组测序分析,c42269_g1基因表达量(FPKM)在‘紫宝’成熟期果皮(PM)中最高,为448.95,相比‘紫宝’幼果期果皮(PY)基因表达量增加9.49倍;遮光处理后的‘紫宝’成熟果皮中c42269_g1基因表达量相比‘紫宝’幼果期果皮(PY)显著下调1.59倍(图1-A)。将FcMYB114(c42269_g1)基因序列的OPF区域与其他果树中R2R3-MYB家族基因的蛋白序列进行序列对比,构建系统进化树。结果显示,c42269_g1基因序列与红皮梨PyMYB114序列相似性达到83.12%;FcMYB114(c42269_g1)基因与拟南芥AtMYB114和碧桃PpMYB9聚类,表明其亲缘关系较近(图1-B)。多重序列比对显示,c42269_g1基因与其他R2R3-MYBs基因在N-末端具有高度同源的R2-R3 DNA结合结构域,以及高度可变的、截短的C-末端区域,进一步证明无花果FcMYB114属于R2R3-MYB转录因子家族成员之一(图1-C)。

A:FcMYB114在不同阶段的表达量;B:FcMYB114系统进化树分析;C:FcMYB114蛋白与其他 MYB 蛋白的同源性分析。A:The expression level of FcMYB114 in different stages; B:FcMYB114 phylogenetic tree analysis; C:Homology analysis of FcMYB114 protein and other MYB proteins.图1 FcMYB114的筛选与进化树分析Fig.1 Screening and phylogenetic tree analysis of FcMYB114

2.2 VIGS技术沉默无花果FcMYB114体系建立

将获得的重组质粒、TRV1、TRV2空载分别转化农杆菌(GV3101)菌株,通过抗性筛选(Kan)与菌液检测确定阳性单克隆。以阳性单克隆及 TRV1单克隆制备实验组侵染液,以空载TRV1和TRV2 农杆菌菌液制备对照组侵染液。用10 mL注射器将侵染液打入‘紫宝’无花果II期的果皮表层,生长一段时间后可在果皮色泽上看到明显的差异(图2-A)。盐酸-甲醇法提取花色苷的结果表明,VIGS技术沉默后的果皮花色苷含量约为CK的38.5%(图2-B)。以处理组和对照组的cDNA为模板,利用花色苷合成途径的结构基因引物(表1)进行PCR反应,每3个果为一组生物学重复,根据1% 琼脂糖电泳条带的亮度初步判断侵染效果。如图2-C所示,沉默基因FcMYB114表达后,花色苷合成结构基因的下游基因以DFR、ANS和UFGT变化最为显著。通过RT-qPCR的进一步验证,发现‘紫宝’成熟期果皮中花色苷合成相关基因的表达量与对照(CK)相比显著下调,其中DFR和ANS下降趋势与PCR反应结果保持一致(图2-D)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

A:VIGS处理组和空载的照片;B:处理组和对照组果皮中花色苷含量;C:在对照和处理组中花色苷合成途径中结构基因的PCR结果;D:在对照和处理组中花色苷合成途径中结构基因的RT-qPCR验证。A:VIGS treatment group and empty photos; B:Anthocyanin content in the peel of the treated group and the control group; C:PCR of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway in the control and treatment groups; D:RT-qPCR verification of structural genes in the anthocyanin synthesis pathway in the control and treatment groups.图2 FcMYB114在‘紫宝’无花果果皮上的VIGS侵染体系Fig.2 The results of VIGS infection system for FcMYB114 in ‘Zibao’ fig

3 讨 论

花色苷存在于花、果皮、果肉、营养组织、块茎和其他器官中,在促进植物繁殖和抗逆性中起重要作用。MYBs被认为是花色苷生物合成调节的主要因素,是植物最大的转录因子之一。云南农业大学园林园艺学院果树生理与品质实验室之前的转录组研究表明,FcMYB114(c42269_g1)是所有被注释为MYB基因中FPKM值最高的。通过遮光试验显示,FcMYB114的FPKM显著下调,可推测其是无花果果皮颜色发育中起决定因素的R2R3-MYB家族基因。系统进化树结果显示,无花果FcMYB114与红皮梨PyMYB114亲缘关系最近,与拟南芥(AtMYB114)和碧桃(PpMYB9)的亲缘关系也相对较近,表明FcMYB114基因在进化过程中高度保守。FcMYB114N-末端具有保守的R2-R3 DNA结合结构域,C-末端为调节区域,进一步证明该基因是MYB家族成员之一。

研究发现,‘红阳’猕猴桃中AcMYB的表达量与花青素含量呈现正相关[21]。欧洲葡萄VvMYB6基因的过表达导致参与类黄酮类物质合成的结构基因显著上调,促进转基因植株花色素的增加[22]。拟南芥中MYB11、MYB12和MYB111通过对早期基因的表达进行调控,进一步促进类黄酮物质的合成[23]。苹果MdMYB308L基因与MdDFR结合,可促进花青素的积累[24]。甜樱桃PaMYB10.1通过激活PaANS和PaUFGT基因的表达来调控花青素的合成[25]。以上研究表明,R2R3-MYB家族转录因子可正向调控花青素合成。本试验对无花果FcMYB114进行沉默处理,转录组与qRT-PCR结果显示,FcMYB114对类黄酮的生物合成起正调控作用,与前人研究结果一致。

4 结 论

通过本研究的结果与分析得出,在pTRV2-FcMYB114介导的无花果果皮中,花青素含量降低;FcMYB114基因沉默处理之后,无花果果皮中类黄酮生物合成代谢途径相关结构基因和转录因子表达量均发生改变,其中FcCHS、FcDFR和FcANS表达量显著下调。研究结果进一步证明FcMYB114转录因子对无花果果皮类黄酮生物合成代谢途径中的花色苷的合成起到正调控作用。