黄飞燕,肜 磊,薛至勤,叶贤文,王志江,谢永辉,柯艳果,赵娅红,吴治兴,吕怡颖,余 磊,潘义宏

(1.昆明学院,昆明 650214;2.云南省烟草公司昆明市公司,昆明 650300;3.西南林业大学化学工程学院,昆明 650224)

【研究意义】烟草根结线虫(Meloidogynespp.)因危害烟株根部,多有瘤状根结,又称为根瘤线虫,部分地方称之为“马鹿根”和“鸡爪根”[1]。根结线虫生命力极强、生活周期短、传播途径多[2],且容易与烟草黑胫病、青枯病和根腐病等其他烟草根茎病害引起复合侵染,使危害程度加重。传统化学防治方法,不仅防治效果不佳,且容易破坏土壤生态环境,造成土壤板结、土壤微生物结构和土壤理化性质改变等问题[3-4]。由此可见,探索根际微生物的功能、微生物群落及其环境因子之间的互作关系对土传病害的防治具有重要意义。【前人研究进展】土壤微生物是土壤的活性部分和土壤生态系统最重要的组成部分,其数量和活性与植物病害发生密切相关[5]。植物感染病原菌,特别是土传病害,根际土壤中的微生物群落结构会发生改变[6-9],健康植株与患病植株根际土壤微生物数量、种类、多样性和丰富度等均呈现显著差异[10-15]。根际土壤中存在大量拮抗微生物类群,可以通过抑制病原微生物活性提高植物抗病性[16-17]。另外,植物根际土壤微生态环境中的生物因子和非生物因子共同作用,影响土壤微生物群落结构的塑造与土传病害的发生与流行[18-20]。【本研究切入点】植物根系、病原菌和根际微生物组成一个小型的生态系统,三者相互影响,相互作用。烟草根结线虫病是典型的土传病害,其发生流行与土壤微生态环境有着密切关系。因此,进一步探明影响烟草根结线虫病发病的土壤微生态环境,寻找绿色生态、环境友好型烟草根结线虫病防治方法迫在眉睫。【拟解决的关键问题】采用Illumina MiSeq高通量测序技术,比较烤烟根结线虫病健康烟株与患病烟株根际土壤真菌群落结构及土壤养分特征,明确烟草根结线虫病发生的微生态机制,以期为相关病害的高效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验烤烟品种为红花大金元(以下简称红大)。试验采用室内盆栽方法,共计2个处理,每盆土壤质量为50 kg,每个处理3盆,每盆定植3株烟,9株烟为1个小区重复,共3次重复。按常规方法育苗,待烟苗4叶1心时,移栽至盆中。供试土壤为最近3年或3年以上均有根结线虫病发生且发病率大于25%的红壤土病土(南方根结线虫,数量≥500 条/g),以同区域最近3年或3年以上没有根结线虫病发生的红壤土作对照。

1.2 样品采集

移栽后60 d随机选取健康株和病株各3株,采用抖动法收集附着在根上0～4 mm 的根际土混合样各1000 g,2个处理,3个重复,共计6个样品。去除土样中的杂物、细根后用无菌密封塑料袋装好并贴上标签,及时带回实验室放-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 样品测定项目及方法

1.3.1 烟株根结线虫病病害情况调查 采用糖水离心漂浮法收集根际土壤根结线虫[21]。按照GB/T 23222—2008的方法调查病土和健康土烟株根结线虫病发病情况,计算发病率和病情指数。

1.3.2 土壤养分测定 参照鲍士旦[22]的方法对土壤pH、有机质、碱解氮、速效钾和速效磷等土壤养分进行检测。

1.3.3 土壤基因组DNA提取 根际土壤样品DNA采用Fast DNA®SPIN Kit (MP,USA)试剂盒提取。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量,DNA浓度和纯度采用NanoDrop 2000进行检测[23]。

1.3.4 18S rRNA基因的PCR扩增及MiSeq测序 针对18S rRNA基因的ITS-1可变区,使用引物ITS2 R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和ITS1 F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)进行PCR扩增[24]。采用TransGen AP221-02DNA合成酶,在ABI GeneAmp®9700型PCR仪上进行扩增,PCR产物回收使用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒(AxyPrepDNA)切胶,Tris_HCl洗脱,2%琼脂糖进行电泳检测。土壤样品高通量测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成(利用Illumina MiSeq平台)。

1.3.5 数据质控及分析 Miseq测序得到的PE reads参照Caporaso等[25]和Edgar Robert等[26]的方法,通过FLASH、Trimmomatic、Usearch(Version 7.0)和Uparse等软件对序列进行拼接、质控和过滤,得到有效序列,并在97%的相似性水平上划分操作分类单元[23];参照Wang等[27]和Altschul等[28]的方法对代表序列进行物种注释。采用Mothur软件(version v.1.30.1)制作稀释度曲线,并计算文库覆盖率(Coverage)、Simpson、Chao1、Shannon及ACE等物种多样性与丰富度指数。土壤样品主坐标分析(PcoA)运用Bray-Curtis距离算法、Qiime软件(Version 1.7.0)进行。采用Vegan软件进行RDA冗余分析,分析样本、菌群和环境因子三者之间的关系;不同环境因子与微生物物种组成的关系利用Spearman相关系数分析,微生物分类与环境因子之间的相关性利用heatmap图评估。

2 结果与分析

2.1 烟株根结线虫病发病情况

烟株根结线虫病发病情况如表1所示:病土烟株发病率为100.00%,健康土烟株发病率为22.62%;病土烟株病情指数为82.93,健康土烟株病情指数为18.89。

表1 病土和健康土烟株根结线虫病发病情况Table 1 Incidence of tobacco root-knot nematodes both in sick soil and healthy soil of different varieties

2.2 烟株根际土壤真菌OTU丰度和Alpha多样性

随着测序数据的上升,基于Shannon指数的稀释度曲线斜率渐渐下降并趋向平坦,表明测序数量足够(图1)。2个处理覆盖率(Coverage)分别为98.30%和98.12%,说明样本测序结果能反应土壤微生物的实际情况,可开展后续的数据分析。

图1 烟株根际土壤中真菌 Shannon 指数稀释度曲线Fig.1 Shannon index-based rarefaction curves of fungus in rhizosphere soils of root-knot nematodes of tobacco plants

根际土壤真菌OUT丰度病株与健康烟株分别为1170和2120个,健康烟株土壤真菌OUT丰度是病株的1.81倍(表2)。健康烟株与病株根际土壤真菌OTUs分布韦恩图(图2)表明,2个处理根际土壤中OTUs一共有3290个,其中共有的OTUs为723个,占总数的21.98%。健康烟株与病株根际土壤特有的真菌OTUs数分别为1397和447个,健康烟株根际土壤特有的真菌OTUs数是病株的3.13倍,说明病害的发生明显降低了真菌OUT丰度。土壤样本Simpson多样性指数值越小,Shannon多样性指数值越大,表明土壤样本中群落多样性越高。本试验中根际土壤Shannon多样性指数病株相比健康烟株降低12.16%,Simpson指数相比健康烟株增加33.33%,表明根结线虫病发生降低了根际土壤真菌微生物群落多样性水平。另外,根结线虫病患病烟株根际土壤中真菌群落丰富度指数ACE较健康烟株降低52.96%(P<0.05),Chao1指数较健康烟株降低50.40%(P<0.05),这说明烟株感染根结线虫病后,会影响根际土壤中土壤真菌微生物群落的丰富度。

图2 烟株根际土壤中真菌OTUs数韦恩图Fig.2 Venn graph of fungus OTUs distribution in rhizosphere soils between root-knot nematodes of tobacco plants

表2 烟株根际土壤真菌OTU丰度和Alpha多样性Table 2 Fungus OTU abundance and alpha diversity index in rhizosphere soils of root-knot nematodesof tobacco plants

2.3 患病烟株与健康烟株根际土壤真菌的群落组成及相对丰度

根际土壤真菌区系在门分类水平上,根结线虫病患病烟株与健康烟株主要由子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、未分类真菌门(unclassified_k__Fungi)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和其它菌门组成(图3)。根结线虫病患病烟株根际土壤中子囊菌门的相对丰度较健康烟株减少29.30%(P<0.05),被孢霉门、未分类真菌门、担子菌门、壶菌门和其它菌门的相对丰度较健康烟株分别增加了94.71%(P<0.05)、203.37%(P<0.05)、58.88%(P<0.05)、18.66%和79.3%。

图3 烟株根际土壤门水平上的真菌丰度Fig.3 Community abundance of fungus on phylum level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

健康烟株根际土壤真菌区系在属水平上主要由被孢霉属(Mortierella,11.27%)、镰刀菌属(Fusarium,11.80%)、茎点霉属(Phoma,6.31%)、未分类丛赤壳科(unclassified_f__Nectriaceae,5.67%)、篮状菌属(Talaromyces,5.58%)、未分类毛壳科(unclassified_f__Chaetomiaceae,5.04%)、未分类真菌界(unclassified_k__Fungi,3.39%)、青霉属(Penicillium,2.33%)等组成(图4),7个属约占总量的51.34%。在属水平上病株根际土壤真菌区系主要由被孢霉属(Mortierella,21.93%)、镰刀菌属(Fusarium,10.86%)、未分类真菌界(unclassified_k__Fungi,10.29%)、青霉属(Penicillium,8.45%)和未分类毛壳科(unclassified_f__Chaetomiaceae,5.63%)组成,5个属约占总量的57.16%。病株根际土壤中被孢霉属、unclassified_k__Fungi属、青霉属的相对丰度分别较健康烟株增加94.59%、203.27%和262.79%,且差异均达到显著水平(P<0.05)。这说明根结线虫病影响烤烟根际土壤真菌群落的分布和相对丰度,易造成某些优势菌群的大量繁殖,导致部分真菌属水平上的比例失衡。

图4 烟株根际土壤属水平上的真菌丰度Fig.4 Community abundance of fungus on genus level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

由图5可知,被孢霉属真菌主要分布于M.sarnyensis和unclassified_g__Mortierella,unclassified_k__Fungi属主要分布于unclassified_k__Fungi,青霉属真菌主要分布于unclassified_g__Penicillium。病株根际土壤中unclassified_g__Fusarium(10.44%)、unclassified_g__Mortierella(14.36%)和unclassified_k__Fungi(10.29%)相对丰度之和为35.09%,而健康烟株根际土壤中三者之和为20.70%。同时,病株根际土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相对丰度较健康烟株分别增加139.01%、134.83%和203.27%,且均达到显著水平(P<0.05)。unclassified_g__Penicillium在根结线虫病病株根际土壤中有明显积累,相对丰度较健康烟株增加361.94%(P<0.05)。总体上根结线虫病对烟株根际土壤真菌群落的组成及相对丰度均有明显影响。

图5 烟株根际土壤种水平上的真菌丰度Fig.5 Community abundance of fungus on species level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

2.4 真菌群落组成的PCoA聚类分析

由图6可知,对根际土壤样品差异性的解释度主成分1(PC1)为69.42%,主成分2(PC2)为10.09%,两者可解释全部土壤样品79.51%的差异。根结线虫病患病烟株的根际土壤真菌群落主要分布在PC1的正值区域,健康烟株的根际土壤真菌群落主要分布在PC1的负值区域,以上结果表明健康烟株和根结线虫病患病烟株的根际土壤真菌物种组成有着明显差异。

图6 烟株根际土壤真菌群落组成的PCoA分析Fig.6 PCoA cluster analysis of fungus community in rhizosphere soils of root-knot nematodes of tobacco plants

2.5 根际土壤真菌群落结构与土壤养分的关联分析

2.5.1 根际土壤养分特征 由表3可知,根结线虫病病株根际土壤pH较健康烟株降低9.47%。有机质含量在二者之间无显著差异。病株水解氮、有效磷和速效氮含量分别较健康烟株增加36.77%(P<0.05)、45.97%(P<0.05)和31.07%(P<0.05)。以上结果说明,健康烟株与病株根系对土壤养分吸收差异明显,病株根际土壤pH较低,水解氮、有效磷和速效氮等含量高于健康烟株。

表3 健康烟株与病株根际土壤养分特征Table 3 Soil nutrient characteristics of rhizosphere soils between health plants and root-knot nematodes infected tobacco plants

2.5.2 关联分析 为分析根际土壤真菌群落结构与土壤养分的关系,以真菌群落在属水平上的丰度数据,健康烟株和发病烟株根际土壤养分数据为土壤环境变量,进行RDA分析即冗余分析(图7)。RDA分析可直观地反映出样品、菌群、环境因子三者之间的关系或者两两之间的关系,样本间距离越近,表示2个样品的微生物群落差异越小。绿色箭头代表不同的物种,物种与环境因子之间的夹角代表二者之间的相关性;红色箭头代表不同的环境因子,箭头越长,表明该环境因子的影响程度越大,环境因子箭头间的夹角代表正、负相关性(锐角:正相关;钝角:负相关;直角:无相关性)。

图7 烟株根际土壤真菌组成与土壤养分的RDA冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of fungus community and soil nutrient in rhizosphere soils of health and root-knot nematodes infected tobacco plants

RDA 1和RDA 2两轴对样品的解释度分别为69.08%和1.17%,两轴累计解释度为70.25%,占主导地位。根际土壤pH、有机质(OM)和水解氮(HN)对菌群的影响程度大于有效磷(EP)和速效钾(AP)。不同养分因子之间均呈不同程度的相关性。

对根际土壤真菌群落(属水平)与土壤养分进行Spearman相关性分析(表4),属水平上相对丰度排名前20的物种中,根际土壤pH与篮状菌属(Talaromyces)、沙蜥属(Saitozyma)等属呈显著正相关,与镰刀菌属(Fusarium)、未分类真菌界(unclassified_k__Fungi)、未分类假球壳目(unclassified_o__Pleosporales)、未分类被孢霉门(unclassified_p__Mortierellomycota)和未分类楼梯孢科(unclassified_f__Stephanosporaceae)等属呈显著负相关。根际土壤有机质(OM)与索诺莱氏菌属(Sonoraphlyctis)呈显著负相关;水解氮(HN)、有效磷(EP)和速效钾(AP)均与被孢霉属(Mortierella)呈极显著正相关,与未分类真菌界(unclassified_k_Fungi)呈显著正相关,与未分类赤壳科(unclassified_f_Nectriaceae)、枝孢霉属(Cladosporium)和小不整球壳属(Plectosphaerella)等属呈显著负相关。

表4 根际土壤真菌群落(属水平)与土壤养分的Spearman相关性分析Table 4 Spearman correlation analysis of rhizosphere soil fungus community(Genus)with soil nutrient factor

续表4 Continuedtable 4

3 讨 论

土壤微生物结构和功能的多样性对维持土壤健康和改善土壤的生态环境极其重要[29-30]。土壤中病原菌常常和其他微生物类群争夺有限的营养物质或生态位资源,容易引起微生物群落结构失调[31],反而加重土传病害发生和传播[32]。土壤微生物多样性和丰富度越高,越能促进植物生长,还能增强植物自身抗性,进而抑制土传病原微生物生长,降低土传病害侵染风险[33]。本研究健康烟株根际土壤特有的真菌OTUs数是病株的3.13倍,说明根结线虫病害的发生明显降低了真菌OUT丰度。根结线虫病患病烟株的Shannon指数相比健康烟株降低12.16%,土壤真菌群落Chao1指数和丰富度指数ACE相比健康烟株分别显著降低50.40%和52.96%,说明根结线虫病发生显著降低烤烟根际土壤真菌群落的多样性和丰富度,这与郑元仙等[23]和陆宁海[13]的研究结果相似。

根际土壤微生物与植物抗病性密切相关,根际土壤中病原微生物和拮抗微生物相互作用,共同影响植物病害发生[34]。本研究中unclassified_g__Fusarium、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi是病株根际土壤真菌群落中的优势菌群,且病株根际土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相对丰度较健康烟株分别增加139.01%、134.83%和203.27%。镰刀菌属(Fusarium)是一类土壤中常见的病原菌,引起的烟株镰刀菌根腐病常与根结线虫病形成复合侵染[35]。被孢霉属(Mortierella)是根际微生物中常见的有益微生物,在促进植物生长和提高植物抵抗力水平等方面具有显著效果[36]。青霉属(Penicillium)真菌能参与到有机物的分解中,有利于土壤多种养分元素的循环并产生活性代谢产物,降解土壤中部分有害物[37],该类真菌对部分镰刀菌属(Fusarium)具有明显抑制作用[38]。本研究中unclassified_g__Penicillium在根结线虫病病株根际土壤中积累明显,约为健康烟株的4.62倍,这可能是烟株抵抗根结线虫病侵染产生的自身抗性反应,或是由于根际微生态系统抗性响应的结果[39]。镰刀菌属(Fusarium)成为根结线虫病患病烟株根际土壤真菌群落中的优势菌群,是否与根结线虫病发生复合侵染,另外被孢霉属(Mortierella)和青霉属(Penicillium)是否与根结线虫和镰刀菌属(Fusarium)产生拮抗作用,还有待进一步研究。

健康烟株与病株根系对土壤养分吸收差异明显,感染根结线虫病烟株根系受损,对土壤养分吸收能力减弱,造成根际土壤养分残留累积。根际土壤真菌群落结构与土壤养分的关联分析结果表明,土壤养分与土壤微生态密切相关,根际土壤pH、有机质和水解氮对根际土壤真菌群落有较大影响。研究表明,烟株土传病害发病率与根际土壤pH呈一定负相关[18]。本研究中根际土壤pH与土壤常见病原菌镰刀菌属(Fusarium)呈显著负相关,发病烟株根际土壤pH呈酸性,显著低于健康烟株,且镰刀菌属(Fusarium)是发病烟株根际土壤中的优势菌群,这说明土壤酸化促进了根际土壤中与根结线虫病复合侵染病原真菌的富集,是引起根结线虫病发生的重要原因。因此调节土壤酸性是控制烟株根结线虫病发生的重要措施。水解氮、有效磷和速效钾等土壤养分与土壤有益微生物被孢霉属(Mortierella)呈极显著正相关。根际土壤真菌群落与土壤养分互作共同影响根结线虫病的发生和流行,二者互作关系和作用机制需要进一步深入研究,从而为根结线虫病防治提供新思路。

4 结 论

本研究表明,烟草根结线虫病发生明显降低了真菌OUT丰度和根际土壤真菌群落的多样性和丰富度。unclassified_g__Fusarium、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi是根结线虫患病烟株根际土壤真菌群落中的优势菌群,且病株根际土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相对丰度较健康烟株高。土壤养分与土壤微生态密切相关,根际土壤pH、有机质和水解氮对根际土壤真菌群落有较大影响。烟株根际微生态结构失调可能是促进根结线虫病加重并与其他病原菌发生复合侵染的主要原因。因此通过有效措施增加根际微生物群落结构的多样性和稳定性、提升烟株根际拮抗微生物活性或降低复合侵染病原微生物活性来预防或减轻土传病害发生可作为烤烟根结线虫病的防控途径。