张 慧,余 端,杭晓宁,马连杰,廖敦秀,卢文才

(重庆市农业科学院农业资源与环境研究所,重庆 401329)

【研究意义】土壤是一个动态的生命系统,提供各种生态系统服务,包括养分循环、碳汇、水分调节等[1]。微生物是土壤的重要组成部分之一,在许多过程中发挥着重要作用,包括土壤团聚体的形成[2]、土壤有机碳分解和养分转化等[3]。土壤微生物群落丰度和组成变化是农业生产系统中土壤生化过程和作物生产力的关键指标[4]。施肥是一种常见的农业管理措施,通过改变土壤理化性质影响作物产量品质及土壤微生物数量、活性及群落组成[5],其中氮肥在保持土壤肥力、提高作物产量、改善作物品质等方面发挥了重要作用,但是长期过量施用会引起土壤酸化板结、供肥能力下降等问题[6-7]。水稻-茎瘤芥轮作是西南丘陵地区重要的农业种植方式之一,而水稻和茎瘤芥种植常存在盲目施肥、过量施肥等现象[8-9],不利于绿色农业发展。因此,为保障粮食安全和特色蔬菜生产,针对西南丘陵区稻菜轮作模式,研究不同施氮处理对土壤微生物多样性的影响,探索绿色高效的施氮方案,减少氮肥对农田生态环境的污染,实现丘陵山区稻田绿色生产具有重要的现实意义。【前人研究进展】研究表明,相较于常规施肥,减施氮肥没有明显降低土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的多样性[10]。也有研究指出适量减氮处理可以增加土壤中细菌菌落的多样性和丰度[11]。与仅施用化肥相比,施用有机肥(如粪肥和稻草)能增强细菌和真菌群落数量和丰度[12-13],在一定程度上影响土壤微生物的生长发育[14];无机有机肥配施可显著提高土壤微生物数量,也可改善微生物特性,提高土壤肥力[15]。陈凯鹏等[16]发现化肥减量配施秸秆能有效改善土壤固氮微生物群落结构,提高土壤固氮潜力。Xun等[17]研究表明,猪粪或牛粪有机肥替换部分化肥可以改善土壤细菌群落结构,增加土壤微生物数量。【本研究切入点】目前有关氮肥减施、秸秆还田、不同耕作方式等对稻田微生物多样性的影响研究较多,而关于水稻-茎瘤芥轮作下氮肥减施对土壤微生物多样性的影响报道较少。【拟解决的关键问题】本研究通过分析不同施氮条件下稻田土壤中微生物多样性及群落结构的差异,明确水稻-茎瘤芥轮作下施氮量对土壤真菌、细菌多样性及群落结构的影响,以期为西南丘陵区水稻-茎瘤芥轮作下氮肥减量施用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于重庆市九龙坡区重庆市农业科学院高科技园区内(106°21′E,29°27′N),种植模式为水稻-茎瘤芥轮作,土壤类型为沙溪庙组紫色水稻土。属亚热带季风性湿润气候,年平均气温16～18 ℃,年平均相对湿度70%～80%,年平均降水量1000～1300 mm,年平均日照时数1000～1400 h,日照百分率仅为25%～35%。土壤基本理化性质:有机质含量15.71 g/kg,全氮含量0.684 g/kg,全磷含量0.645 g/kg,全钾含量25.3 g/kg,有效磷含量12.5 mg/kg,速效钾含量68 mg/kg。

1.2 试验设计

试验设置4个施氮处理,分别为不施氮肥(CK)、氮肥全量施用(即常规施肥量T1)、减施氮肥(T2)、氮肥有机肥配施(T3)处理,小区面积为84 m2(12 m×7 m),处理间设置0.5 m宽的田埂作为隔离带,每处理重复3次,随机排列。水稻氮肥分3次施入,分别为基肥、分蘖肥、穗肥,其中对照处理(CK)3次施氮量分别为0、0、0 kg/hm2,T1处理3次施氮量分别为75、60、15 kg/hm2,T2处理3次施氮量分别为60、45、15 kg/hm2,T3处理基肥为氮肥60 kg/hm2+有机肥200 kg/hm2,分蘖肥、穗肥施氮量分别为45、15 kg/hm2。试验中P2O5施用量均为90 kg/hm2,K2O施用量均为120 kg/hm2,尿素(N)、过磷酸钙(P2O5)和钾肥(K2O)的有效养分含量分别为46%、12%和60%,肥料均购自广东天禾农资股份有限公司。茎瘤芥是一次性施基肥,各处理田间管理保持一致。

1.3 土壤微生物检测

水稻收获后,采用5点取样法,用土钻在每个小区采集0～10 cm土层土样,取混合土样50 g,去除土样中的植物残体等杂质,放入保温箱中带回实验室后置于超低温冰箱,用于土壤真菌、细菌的丰度和多样性测定。土壤样品送到上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina Miseq高通量测序。对细菌的16S rRNA的V3～V4区进行PCR扩增,引物序列为:F-ACTCCTACGGGAGGCAGCA,R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT;对真菌ITS的V1区进行PCR扩增,引物序列为:F-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG,R-GCTGCGTTCTTCATCGATGC。PCR反应体系:扩增体系25 μL,其中5×reaction buffer 5 μL,5×GC buffer 5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL,Forward primer(10 μmol/L)1 μL,Reverse primer(10 μmol/L)1 μL,DNA Template 2 μL,ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR 反应条件:98 ℃ 2 min,98 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,25～30个循环。

1.4 数据处理分析

采用Vsearch[18]方法对序列进行去引物、拼接、质量过滤、去重、去嵌合体、聚类,对样本中所包含的高质量序列进行统计。采用稀疏的方法对ASV/OTU的丰度表进行抽平[19-20],通过对抽平后的ASV/OTU表格进行统计,获得每个样本中的微生物群落在各分类水平的具体组成表。Alpha和Beta多样性分析采用QIIME、R语言、ape包等实现。为能较全面地评估微生物群落的Alpha多样性,本试验以Chao1指数[21]和Observed指数表征丰富度,以Shannon指数[22]和Simpson指数[23]表征多样性,Beta多样性通过计算Bray-Curtis[24]距离矩阵进行主坐标轴分析[25]。使用QIIME软件,获取各样本在门水平上的组成和丰度分布表,比较微生物的分布情况。使用R语言、pheatmap包等进一步比较样本间的物种组成差异。

2 结果与分析

2.1 测序数据统计

16S序列测序数据经过拼接后,12个样本共得到877 125条序列,每个样本45 898～81 692条,平均序列长度为387 bp;97%相似性归并后,CK、T1、T2、T3处理分别获得9303、9371、10 514、10 114个细菌OUT。ITS序列测序数据经过拼接后,12个样本共得到895 116条序列,每个样本58 561～116 935条,平均序列长度为250 bp;97%相似性归并后,CK、T1、T2、T3处理分别获得880、1002、874、903个真菌OUT。不同处理下细菌和真菌群落在门、纲、目、科、属上存在一定的差异,物种分类学注释结果统计详见表1。

表1 不同施氮处理下土壤细菌和真菌的物种分类学注释结果统计Table 1 Statistics of taxonomic annotation results of soil bacteria and fungi under different nitrogen treatments

2.2 微生物群落Alpha多样性分析

土壤细菌和真菌群落Alpha多样性分析结果表明(表2),与CK相比,T1处理的细菌群落丰富度降低,T2、T3处理的细菌群落丰富度增加,但处理间差异不显著(Chao1指数和Observed指数,P>0.05);处理T1、T2、T3的细菌Shannon指数和Simpson指数均高于CK处理,差异未达显著水平。处理T1、T2、T3的真菌Chao1指数和Observed指数均高于CK处理,而Shannon指数和Simpson指数均低于CK处理,处理间差异未达显著水平。结果表明,各处理土壤真菌和细菌物种的均匀度一致,减施氮肥和氮肥有机肥配施可以增加细菌群落的丰富度,降低真菌群落的丰富度。

表2 不同施氮处理下土壤细菌、真菌群落的丰富度和多样性指数Table 2 Richness and diversity index of soil bacterial and fungal communities under different nitrogen treatments

2.3 微生物群落Beta多样性分析

基于ASV分类学水平的PCoA分析,采用Bray-Curtis距离算法,得出细菌(图1-A)群落和真菌(图1-B)群落的PCoA第一坐标贡献度分别为16.0%和24.6%;CK、T1、T2、T3处理的土壤细菌群落组成基本相似,处理间的菌群结构无明显差异;CK、T1、T2处理的土壤真菌群落距离T3处理较远,说明真菌物种组成有一定的差异性。结果表明,不同施氮处理对真菌群落结构的影响较大。

A.细菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.图1 基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标轴分析Fig.1 Principal coordinate axis analysis based on Bray-Curtis distance matrix

2.4 微生物群落结构

由图2-A可知,所有处理细菌群落中,变形菌门(Proteobacteria,相对丰度31.49%～34.57%)和放线菌门(Actinobacteria,相对丰度30.10%～34.57%)是最丰富的门,其次是绿弯菌门(Chloroflexi,相对丰度17.07%～20.77%)、酸杆菌门(Acidobacteria,相对丰度4.85%～5.71%),这4个优势菌门累计相对丰度为89.09%～89.77%;与CK处理相比,施氮处理增加了Proteobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes和Bacteroidetes的相对丰度,降低了Actinobacteria、Acidobacteria和Nitrospirae的相对丰度,但处理间差异不显著。由图2-B可知,所有处理真菌群落中,子囊菌门(Ascomycota)是最丰富的门,平均相对丰度为59.04%～74.06%,其次是被孢霉门(Mortierellomycota,相对丰度4.56%～9.55%)、担子菌门(Basidiomycota,相对丰度1.72%～4.62%),这3个优势菌门累计相对丰度为70.90%～80.35%。与CK处理相比,施氮处理的Ascomycota相对丰度增加,罗兹菌门(Rozellomycota)和油壶菌门(Olpidiomycota)相对丰度显著增加;T1处理的担子菌门和球囊菌门(Glomeromycota)相对丰度增加;T2处理的被孢霉门相对丰度增加,毛霉门(Mucoromycota)相对丰度显著降低;T3处理的毛霉门相对丰度增加,但处理间差异达不到显著水平。

A.细菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.图2 不同施氮处理的土壤细菌和真菌门水平分布Fig.2 Horizontal distribution of soil bacteria and fungi under different nitrogen treatments

选取相对丰度排名前20的细菌和真菌菌属,绘制Heatmap,色块由蓝到红代表相对丰度由低到高。由图3-A可知,CK、T3、T2处理的细菌群落组成相似度较高,属于同一分枝;T1属于另一聚类分枝。与CK相比,T1、T2、T3处理均降低了Thiobacillus、MB-A2-108菌属和Subgroup_17的丰度,提高硫碱螺旋菌属(Thioalkalispira)和Geobacter的丰度,处理间差异不显著;T1处理中Latescibacteria、Sulfurifustis、A4b、67-14、KD4-96、分支杆菌(Mycobacterium)的丰度最高;处理T3的SJA-15丰度最高。由图3-B可知, T3、T1和T2处理的真菌群落组成相似度较高,属于同一分枝;CK处理属于另一聚类分枝。与T3相比,T1、T2处理的顶囊壳属(Gaeumannomyces)和Pyrenochaetopsis丰度增加;T2处理显著增加了Mortierella和Neodevriesia的丰度;T3处理显著提高了链孢霉(Neurospora)、腐质霉属(Humicola)、Pseudaleuria、镰刀菌属(Fusarium)、Penicillium的丰度,降低了球腔菌属(Mycosphaerella)、链格孢属(Alternaria)、黄丝曲霉属(Talaromyces)、Serendipita、Pseudeurotium、光黑壳属(Preussia)、枝顶孢属(Acremonium)、油瓶霉属(Lecythophora)、Ramophialophora的相对丰度。

A.细菌;B.真菌。A.Bacteria;B.Fungi.图3 不同施氮处理的土壤微生物组成Fig.3 Soil microbial composition under different nitrogen treatments

3 讨 论

土壤微生物多样性与群落结构、生态功能的稳定性之间总体上存在线性关系,一般情况下,土壤微生物丰度越高,群落组成越复杂,土壤微生态的功能稳定性越强[26-27]。施肥不均衡会导致土壤有效养分失衡、生产力下降,从而抑制土壤微生物活性,不利于参与土壤养分循环的微生物繁殖,进而导致土壤微生物多样性下降[28]。适量减施氮肥可以增加土壤中细菌群落的多样性[11],有机无机肥配施能够增加土壤微生物多样性,改变土壤微生物群落结构[29]。本研究比较不同施氮处理的土壤微生物α多样性,发现土壤中细菌和真菌的多样性指数变化趋势各不相同,施用氮肥未能显著改变土壤微生物群落丰度,这可能与茎瘤芥施肥有关[30]。从土壤细菌PCoA分析图也可以看出,各处理土壤细菌结构存在大量重叠区域,说明减施氮肥并未显著改变土壤中细菌结构。

水稻土壤中细菌群落结构和多样性易受土壤类型、土壤理化性质、施肥方式等因素的影响[31]。高通量测序结果表明,变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门是施氮土壤中主要的细菌群落,以变形菌门和放线菌门为主,T3、T2处理的变形菌门相对丰度高于T1、CK处理,说明氮肥减施和氮肥有机肥配施有利于该类细菌的生长繁殖;CK处理的放线菌门相对丰度高于施氮处理,说明氮肥施用不利于放线菌门的生长;T2处理的硝化螺旋菌门、芽单胞菌门丰度高于其他处理,说明氮肥减施可为有益微生物生长提供有利的生境;绿弯菌门有利于土壤中有毒有害物质的降解[32],其相对丰度T2处理高于其他处理,说明氮肥减施后土壤中的有毒有害物质积累减弱,对土壤健康有益[33]。土壤中氮素含量显著影响真菌的多样性、丰度和组成[34]。不同施氮土壤中真菌的优势菌群均为子囊菌门,且施用氮肥处理的子囊菌门相对丰度均大于60%,这一结果说明子囊菌门的生长受氮素含量的影响较大,且氮肥会促进其优势菌的生长[35]。

本研究在一定范围内揭示了水稻-茎瘤芥轮作条件下土壤细菌和真菌多样性和结构对不同施肥量的响应。然而,土壤本身是一个复杂的系统,受人为因素影响较大,对土壤细菌、真菌与其他理化因子的生物调控机理有待于深入挖掘。此外,不同施氮量对土壤病原真菌的影响还有待进一步研究。虽然本研究在一定程度上分析了土壤细菌和真菌群落的组成,但具有一定的局限性,土壤细菌和真菌与氮素转化相关的功能微生物仍有待深入研究。

4 结 论

长期氮肥减施、氮肥有机肥配施使土壤细菌群落丰富度升高,真菌群落的丰富度降低。氮肥配施有机肥与其他处理的细菌菌群结构相似度较高,氮肥全量和氮肥减施处理的真菌菌群结构相似度较高,其他处理间真菌结构差异较大。不同氮肥施用水平的土壤细菌优势菌群均为变形菌门,真菌优势菌群均为子囊菌门,且氮肥施用均可提高土壤变形菌门、子囊菌门的相对丰度。在水稻-茎瘤芥轮作模式下,减施氮肥、氮肥有机肥配施对土壤中微生物群落组成和丰度没有产生显著影响,研究结果有助于准确了解减氮处理的土壤微生物结构变化,为氮肥减量施用提供理论支撑。