尹丽兴

(上海工程技术大学数理与统计学院, 上海 201620)

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米为商业化的“郑单958”普通玉米。取新鲜玉米种子用去离子水避光浸泡3 d,随后播种在含有蛭石的营养土中,于自然光照、45%的相对湿度环境下生长10 d。对10日龄的玉米进行胁迫处理,其中以水灌溉玉米为对照,以200 mmol/L盐碱(50 mmol/L NaCl、50 mmol/L Na2SO4、50 mmol/L Na2CO3和50 mmol/L NaHCO3)灌溉玉米作为处理组,对照组与实验组分别处理5 d。收集不同的玉米组织(根、茎和叶),迅速于液氮中充分研磨后,一部分于-80 ℃保存,一部分交由北京百迈克生物科技有限公司(www.biomarker.com.cn)进行RNA提取与文库构建、测序分析。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA 提取及建库测序 RNA提取、建库测序以及基因功能注释由北京百迈克生物科技有限公司完成,转录组测序数据与玉米B73参考基因组数据比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/ GCF_902167145.1)。将获得的clean reads 在NR、COG、KOG、KEGG、GO、eggNOG和 Pfam数据库中比对,获得基因的注释信息。

1.2.2 差异表达基因分析 在北京百迈克生物科技有限公司云平台(www.biocloud.net)上完成差异表达基因(Differentialy expressed genes, DEGs)分析。基因的表达丰度用 FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)值表示。使用DESeq2_edgeR软件进行差异基因分析,并设置参数FDR ≤ 0.01、 log2FC ≥ 2作为筛选差异表达基因的标准。

1.2.3 叶绿素含量测定 参考Vernon[15]的方法测定玉米叶片中的叶绿素含量。取玉米叶片样品(0.2 g)在液氮中研磨,用80%丙酮提取3次,随后加入丙酮至总体积为10 mL,离心获得上清液。使用NanoDrop One 2000C超微量紫外-可见分光光度计检测叶绿素溶液在649和665 nm波长下的吸光度。叶绿素a/b含量计算公式为:叶绿素a =13.95A665-6.88A649,叶绿素b=24.96A649-7.32A665。

1.2.4 总木质素含量测定 采用巯基乙酸法测定总木质素含量[16]。将新鲜的玉米茎秆于液氮中研磨,取0.1 g植物粗粉添加10倍体积的无水甲醇,80 ℃提取2 h。提取液离心弃液,植株粗粉沉淀用10倍体积蒸馏水洗涤,离心弃液;沉淀中依次添加750 μL蒸馏水、250 μL浓盐酸、100 μL巯基乙酸(比例15∶5∶2),于80 ℃孵育3 h,离心弃液。将沉淀重悬于1 mL 1 mol/L的氢氧化钠中,室温缓慢摇动12 h,随后离心弃去沉淀,上清液转移至新的离心管中,加入200 μL浓盐酸,于4 ℃孵育4 h。最后将提取液离心10 min,沉淀溶于1 mL 1 mol/L的氢氧化钠中,使用NanoDrop One 2000C超微量紫外-可见分光光度计检测溶液在280 nm下的吸光度(单位:A280 nm/mg FW)。

1.2.5 木质素单体含量测定 使用酸水解法测定木质素单体含量[17-18]。玉米茎秆样品于液氮中研磨;样品粉末分别用丙酮浸泡4 h,甲醇浸泡24 h,再用热水提取 30 min,随后于45 ℃烘干备用;称取烘干后的样品10 mg,加入200 μL 新鲜配置的反应液(终浓度为2.5%的三氟化硼乙醚和10%的乙硫醇溶于二氧六环,即:175 μL dioxane+20 μL EtSH+5 μL BF3),于100 ℃恒温烘箱反应4 h,再置于冰上5 min停止反应;在反应液中添加0.4 mol/L的碳酸氢钠(33.6 mg/mL),调节 pH 为3～4;反应液中添加1 mL水、0.5 mL乙酸乙酯涡旋,吸取上层乙酸乙酯150 μL至新的离心管中蒸干;在离心管中添加0.5 mL乙酸乙酯、20 μL 嘧啶和 100 μL N,O-双三甲基硅基乙酰胺,25 ℃静置 4 h作为待测液。取 100 μL 待测液,添加正二十二烷和100 μL丙酮进行GC-MS 分析。质谱图中质荷比m/z 239为H型木质素,m/z 269为G型木质素单体,m/z 299 为S木质素单体[19]。

GC-MS条件:仪器Agilent 7890B-7000D,色谱柱Agilent 9091J-433 HP-5(30 m×250 μm ×0.25 μm);压力8.3852 psi;进样口温度250 ℃,初始温度50 ℃;升温程序:50 ℃保持1 min, 以35 ℃/min由50 ℃升温至220 ℃,以0.5 ℃/min由220 ℃升温至230 ℃,以0.5 ℃/min由230 ℃升温至280 ℃,并于280 ℃保持5 min。EI 离子源,电子能量70 eV,质谱分子量扫描范围30～400 amu。数据分析使用 MSD ChemStation软件。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫下玉米的表型和叶绿素含量

在200 mmol/L盐碱溶液浇灌处理下,玉米叶片呈现干枯、萎奄、脱水等表型,其植株高度比对照组矮,表明盐碱胁迫抑制了玉米的生长(图1-A)。采用紫外分光光度法测定玉米叶片中总叶绿素含量,结果表明盐碱胁迫下玉米叶片中叶绿素含量降低,其中对照组玉米叶片中叶绿素总含量为(0.729±0.047) mg/g FW,而盐碱处理组玉米叶片中叶绿素总含量降至(0.507±0.53) mg/g FW(图1-B)。尽管盐碱胁迫降低了叶绿素的含量,但与对照组相比并无显著差异,叶绿素含量测定结果表明玉米“郑单958”具有一定耐盐碱性。

A.盐碱胁迫下玉米的表型;B.紫外-可见分光光度法测定玉米叶绿素含量;C.玉米对照组;T.玉米盐碱胁迫处理组;实验为3次生物学重复,数值为平均值±SD,下同。A.The phenotypes of maize under saline-alkaline treatment; B.Quantification of chlorophyll by UV-Vis spectroscopy method; C.Normal growing group; T.Saline-alkaline treated group;Values represent the mean of three replicates ±SD, the same as below.图1 盐碱胁迫对玉米表型和叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of saline-alkaline stress on phenotypes and chlorophyll content of maize

2.2 盐碱胁迫下玉米的总木质素及木质素单体含量变化

总木质素含量测定结果显示,对照组玉米中的总木质素含量为(0.172±0.011) A280 nm/mg FW,而盐碱胁迫组玉米中的总木质素含量为(0.118±0.014 ) A280 nm/mg FW,与对照组相比,总木质素含量降低31.26%,表明盐碱胁迫抑制了玉米木质素的生成(图2-A)。

进一步分析组成木质素的3种单体的含量,首先采用酸水解法将木质素聚合物水解为3种木质素单体,水解产物经衍生化后,使用GC-MS质谱联用仪测定。在质谱图上,木质素的3种单体对羟基苯基木质素(H)、愈创木基木质素(G)和丁香基木质素(S)的保留时间分别为20.134、23.280和26.707 min,其质荷比(m/z)分别为239.1、269.1和299.1。木质素单体含量分析表明,在正常生长的玉米中H、G和S型木质素相对含量分别为2.39%、59.17%和38.44%,而盐碱胁迫处理组的玉米中H、G和S型木质素相对含量分别为2.25%、61.67%和36.08%(图2-B、2-C)。表明盐碱胁迫抑制了玉米中H和S型木质素单体的合成,但促进了G型木质素单体的合成。

A.巯基乙酸法测定总木质素含量; B和C.酸水解法测定玉米中H、G和S型木质素单体的含量;**表示P<0.01。A.Quantification of the total lignin content by thioglycolic acid method; B and C.Quantification of H-, G- and S-type monolignols by the thioacidolysis method; **indicate significant differences at P<0.01.图2 盐碱胁迫下玉米总木质素和3种木质素单体的含量Fig.2 Content of lignin and three monolignols in saline-alkaline stress treated maize

2.3 转录组数据分析和新基因挖掘

对玉米正常生长组和盐碱胁迫组转录组测序,获得16.14 Gb clean data,组装后得到54 922 262条reads。将clean reads与玉米B73参考基因组进行比对,共有39 722个基因比对成功,对照组和处理组的比对率分别为86.47%和85.65%。

在玉米转录组数据中鉴定出5659个新基因,其中,2950个基因在蛋白质数据库中获得注释。在Nr数据库中注释了2825个基因(95.76%),其次是GO数据库(1455个, 49.32%)、eggNOG(1437个, 48.71%)、KEGG(971个, 32.92%)、Swiss-Prot(791个, 26.81%)、Pfam(789个, 26.75%)、KOG(724个, 24.54%)和COG(202个,6.85%)。对这些新基因进行GO富集分析,这些新基因被富集到生物过程(Biological process, BP)、细胞组分(Cellular component, CC)和分子功能(Molecular function, MF)三类。在BP分类中,基因主要富集到细胞过程(Cellular process)、代谢过程(Metabolic process)和生物调节过程(Biological regulation);在CC分类中,基因主要富集到细胞解剖实体(Cellular anatomical entity)、细胞内(Intracellular)和蛋白质复合物(Protein-containing complex)。在MF分类中,基因富集到结合功能(Binding)、催化活性(Catalytic activity)和转运活性(Transporter activity)(图3-A)。COG功能注释显示这些新基因中,24个基因(占11.88%)与氨基酸转运和代谢相关,23个基因(11.39%)与碳水化合物转运和代谢相关,20个基因(9.90%)与信号转导机制相关等(图3-B)。将这些新基因与Nr数据库中的基因进行同源性分析,发现有1890个基因与Nr数据库中的其他基因具有90%～100%的同源性(图3-C);在Nr同源物种分布中,有59个基因(2.09%)比对到高粱(Sorghumbicolor),39个基因(1.38%)比对到日本晴水稻(Oryzasativajaponica),31个基因(1.10%)比对到长梗蕉(Musabalbisiana)(图3-D)。

A.新基因的GO注释富集分析;B.新基因的COG功能分类;C.新基因在Nr数据库中的序列相似度比对;D.新基因在Nr数据库中比对到的物种分布。A.GO enrichment of new genes; B.COG functional categories of new genes; C.Nr identify distribution of new genes; D.Nr species distribution of new genes.图3 新基因的GO、COG注释和Nr物种分布Fig.3 GO, COG annotation and Nr species distribution of new genes

2.4 差异表达基因的GO和KEGG分析

盐碱胁迫处理后,在玉米中共有12 432个差异表达基因,包含6102个上调基因和6330个下调基因。在这些DEGs中,有11 791个基因获得注释,包含727个注释为转录因子的基因,其中注释转录因子最多的是WRKY类。

对这些已注释的DEGs进行GO功能分析。在BP分类中,DEGs主要富集在细胞过程、代谢过程和单一有机体过程(Single organism process);在CC分类中,DEGs主要富集在细胞(Cell)、细胞组分(Cell part)和细胞器(Organelle);在MF分类中,DEGs主要富集在结合功能、催化活性和转运活性(图4-A)。

KEGG富集分析表明,这些DEGs主要富集在植物-病原体相互作用(ko04626, 326个基因)、核糖体(ko03010, 236个基因)、碳代谢(ko01200, 192个基因)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500, 186个基因)、苯丙烷生物合成(ko00940, 161个基因)等途径(图4-B)。盐碱胁迫处理下,玉米中上调的基因主要富集在植物激素信号转导(ko04075, 177个基因)、MAPK信号通路(ko04016, 134个基因)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500,86个基因)以及苯丙烷生物合成(ko00940,85个基因)等(图4-C)。下调基因富集在核糖体(ko03010,225个基因)、碳代谢(ko01200,11个基因)、淀粉和蔗糖代谢(ko00500,100个基因)、氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520, 69个基因)、光合作用(ko00195, 63个基因)等代谢通路(图4-D)。

A.DEGs的GO功能分类;B.DEGs的KEGG功能富集;C.上调表达的DEGs的KEGG功能富集;D.下调表达的DEGs的KEGG功能富集。A.GO classification of the DEGs; B.KEGG functional enrichment of the DEGs; C.KEGG functional enrichment of the up-regulated DEGs; D.KEGG functional enrichment of the down-regulated DEG.图4 盐碱胁迫下玉米中差异表达基因的GO和KEGG富集分析Fig.4 GO and KEGG functional enrichment of DEGs in maize under saline-alkaline stress

2.5 叶绿素生物合成相关的DEGs分析

为阐明盐碱胁迫影响叶绿素生成的分子机制,对卟啉和叶绿素代谢途径(ko00860)上的DEGs进行挖掘和分析。共有87个基因注释到该通路,其中差异表达基因41个,差异表达基因中有14个基因上调(图5-A、5-B)。在这些DEGs中,基因LOC100281115注释为叶绿素合成酶,在盐碱胁迫下,其表达量FPKM值下降(对照组为159.49,盐碱处理组为74.28),该基因下调表达;注释为叶绿素酶的基因LOC103632406和注释为叶绿素b 还原酶的基因LOC100281115上调表达。这些与叶绿素合成和分解相关的基因表达量的变化导致了玉米叶片中叶绿素生成的减少(图5-C)。

A.卟啉和叶绿素代谢途径上DEGs的火山图;B.卟啉和叶绿素代谢途径上DEGs的热聚类分析;C.叶绿素生物合成途径上主要DEGs的表达分析。红色填充表示基因上调,绿色填充表示基因下调,蓝色填充表示注释为该酶的基因既有上调又有下调表达,无颜色填充表示注释到该酶的基因表达量无差异。A.Volcano plot of DEGs in porphyrin and chloro-phyll metabolism pathway; B.Thermal cluster analysis of DEGs in porphyrin and chlorophyll metabolism pathway; C.The main DEGs in chlorophyll biosynthesis pathway.The red blocks represented the up-regulated genes, green blocks represented the down-regulated genes, blue blocks represented the genes up-/down- regulated, blocks without color represented no changes in genes expression level under saline-alkaline stress.图5 盐碱胁迫下玉米叶绿素生物合成相关基因的表达分析Fig.5 Expression analysis of genes related to chlorophyll biosynthesis in maize under saline alkali stress

2.6 木质素生物合成相关的DEGs分析

植物中木质素是在苯丙烷生物合成途径(ko00940)上合成的。为阐明盐碱胁迫下木质素含量与其生物合成途径上相关基因表达水平的关系,对苯丙烷生物合成途径上的DEGs进行分析。在苯丙烷生物合成途径上共挖掘到361个基因,其中161个基因为DEGs,85个DEGs上调表达(图6-A)。这些DEGs包括PAL(3个)、C4H(4个)、F5H(2个)、4CL(4个)、HCT(17个)、COMT(3个)、CCR(13个)、CAD(10个)和PER(66个)(图6-B)。在这些DEGs中,注释为C4H的基因均上调表达,而其他调控木质素生物合成的关键基因如CCR和CAD既有上调表达又有下调表达(图6-C)。这些DEGs表达水平的变化与其参与不同的生理过程有关,其中部分基因可能参与木质素的生成,可能导致总木质素和木质素单体含量的变化。

A.苯丙烷生物合成途径上DEGs的火山图;B.苯丙烷生物合成途径上DEGs的表达量的差异倍数分析;C.木质素生物合成途径上基因的表达分析。红色填充和箭头表示基因上调,绿色填充和箭头表示基因下调,蓝色填充和箭头表示注释到该酶的基因既有上调又有下调,无颜色填充表示注释到该酶的基因表达量无差异。括号中的数字代表上调或下调表达的基因的数量,下同。A.Volcano plot of DEGs in phenylpropanoid biosynthesis pathway; B.The log2FC value of DEGs associated with lignin biosynthesis; C.Simplified biosynthetic pathway of lignin.The red blocks and arrows represented the up-regulated genes, green blocks and arrows represented the down-regulated genes, blue blocks represented the genes up-/down- regulated, blocks without color represented no changes in genes expression level under saline-alkaline stress.The numbers in bracket were amount of up- or down- regulated genes,the same as below.图6 盐碱胁迫下玉米木质素生物合成相关基因的表达分析Fig.6 Expression analysis of genes related to lignin biosynthesis in maize under saline alkali stress

2.7 植物激素信号转导相关的DEGs分析

盐碱胁迫下,玉米中共有915个基因注释到植物激素信号转导通路(ko04075),其中有342个基因为DEGs。差异表达基因中, 177个基因表达量上调,165个基因表达量下调(图7-A)。在植物激素信号转导通路上的这些DEGs中,90个基因注释为转录因子,其中AUX/IAA是注释最多的转录因子家族,其次是GRAS和GARP(图7-B)。这些差异表达基因中,与吲哚乙酸生成和信号转导相关的基因有75个,与细胞分裂素相关的基因有40个,与其他植物激素相关的有赤霉素(47个)、脱落酸(33个)、乙烯(21个)、油菜素甾醇(77个)、茉莉酸(26个)和水杨酸(24个),其中,与有脱落酸(Abscisic acid)相关的33个差异表达基因中有15个基因注释为PP2C,其中1个基因下调;7个基因均注释为ABF,这些ABF基因均上调表达(图7-C)。植物激素信号转导通路上的DEGs分析表明玉米可能采用多种信号转导机制应对盐碱胁迫。

A.植物激素信号转导途径上DEGs的火山图;B.注释到植物激素信号转导途径上的转录因子;C.植物激素信号转导途径上基因的表达分析。A.Volcano plot of DEGs in plant hormone signal transduction pathway; B.The differentially expressed transcription factors in plant hormone signal transduction pathway; C.The main DEGs in plant hormone signal transduction pathway.图7 盐碱胁迫下玉米中植物激素信号转导途径上基因的表达分析Fig.7 Gene expression analysis of plant hormone signal transduction pathway in maize under saline alkali stress

3 讨 论

3.1 盐碱胁迫抑制玉米中叶绿素的生成

前人研究表明,盐碱胁迫会抑制植物种子的萌发,导致植物枯萎、死亡,使作物产量急剧下降[20-21]。本研究表明,在盐碱胁迫下玉米幼苗呈现出生长减慢,叶片枯萎等表型,生化分析显示玉米叶片中叶绿素含量降低30.45%,本研究结果与文献报道一致[22]。进一步分析叶绿素a/b生物合成途径中基因的表达水平,发现一个编码叶绿素合成酶([EC:2.5.1.62])的基因LOC100274372表达量下调,一个编码叶绿素酶([EC:3.1.1.14])的基因LOC100274372和编码叶绿素b还原酶([EC:1.1.1.294])的基因LOC100281115表达量上调。叶绿素a/b生物合成相关基因的表达量变化与检测到的叶绿素含量变化一致,表明盐碱胁迫通过调控叶绿素合成酶、叶绿素酶和叶绿素b还原酶基因的表达来调控叶绿素的生成。据报道,叶绿素酶活性与光系统II有关,在盐碱胁迫下,叶绿素的降低可能与光合作用有关,推测盐碱胁迫可能通过降低玉米光合作用最终导致产量的减少[23]。

3.2 盐碱胁迫显著影响玉米中木质素的生物合成

本研究表明,盐碱胁迫下玉米中总木质素含量降低31.26%。进一步对H、G和S共3种木质素单体的含量分析,结果显示H型和S型木质素相对含量降低,而G型木质素的相对含量增加。为揭示木质素含量和其生物合成通路上基因表达的关系,本研究挖掘了161个参与苯丙烷生物合成的基因。这些基因中,部分CCR、CAD、PER等木质素合成的关键基因表达量上调或下调,推测这些基因中的部分基因参与木质素的生成。据报道,CCR和CAD在植物生长发育中发挥着重要的作用,有的基因参与木质素的生成,有的参与生物或非生物胁迫[24-25]。因此,挖掘到的这些木质素生物合成相关的差异表达基因,其中一些下调的基因可能参与木质素的生成,而另一些上调的基因可能参与其他次生代谢(如酚酸)的生成以帮助植物抵御盐碱胁迫。

3.3 转录因子参与玉米应对盐碱胁迫

转录因子是基因表达的关键调控因子,在植物中具有多种功能。转录因子通过在转录水平上激活或抑制基因表达来帮助植物应对非生物胁迫。在本研究中,从玉米转录组测序数据中总共挖掘到了727个响应盐碱胁迫的转录因子,其中数量最多的是WRKY家族成员,其次是AP2/ERF家族。研究表明AP2/ERF转录因子是植物应激反应的关键调控因子,它能调控大量基因在高温、干旱、盐、低温等非生物胁迫中的表达。正常情况下,AP2/ERF 转录因子处于低水平表达,而激素和非生物胁迫可诱导该类基因的表达[26]。在本研究中,这727个转录因子在盐碱胁迫下表现出不同的表达水平,这些候选转录因子可以进一步的选择性研究,以阐明玉米盐碱胁迫下的响应机制。

3.4 盐碱胁迫诱导植物激素信号转导通路上基因的表达

植物激素在植物生长和应对环境胁迫中起着重要作用。在所有与植物信号转导相关的激素中,脱落酸(ABA)被认为是与干旱、盐和低温关系最密切的激素。ABA信号转导通路涉及的主要酶包括PYR1、RCAR、PP2C和SnRK2s,其中PP2C是ABA信号的重要传递者,它负向调控ABA信号[27]。本研究中,有15个基因注释为PP2C,其中1个基因下调;7个基因均注释为ABF,这些基因均上调表达,而ABF的上调可能导致气孔关闭。吲哚乙酸(Auxin)是植物生长发育的重要成分,它影响植物细胞分裂、细胞伸长和胚胎发育。研究表明Aux/IAAs与ARF结合,负调控基因转录,它可以调控AUX/IAA、GH3和SAUR基因的表达[28-29]。在本研究中,筛选到了注释为AUX/IAA、GH3和SAUR的多个基因,它们在盐碱胁迫下差异表达。结果表明,脱落酸、吲哚乙酸等多种激素信号通路相互交织,共同参与玉米对盐碱胁迫的响应。

4 结 论

对玉米“郑单958”进行盐碱胁迫处理,探讨了盐碱胁迫对玉米中木质素的影响及木质素生物合成途径上基因表达水平的影响。盐碱胁迫抑制玉米总木质素的合成,其中H型和S型木质素相对含量降低,而G型木质素的相对含量增加。通过转录组测序挖掘到苯丙烷生物合成途径上161个差异表达基因,这些差异表达基因可作为重点基因进行功能研究。因此,本研究结果为通过基因工程遗传育种提升玉米木质素含量,提升玉米的农业经济价值提供重要数据。