邢丽红,李兆新,2*,孙晓杰,2,张梦婷,2,郑旭颖,2,王继耀,2,王淑文,2,周朝生,朱洁,丁环,刘云龙

(1.中国水产科学研究院黄海水产研究所,山东 青岛 266071;2.农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(青岛),山东 青岛 266071;3.浙江省海洋水产养殖研究所,浙江 温州,325005;4.浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室和温州市海洋生物遗传育种重点实验室,浙江 温州 325005;5.山东众合天成检验有限公司,山东 青岛 266071)

自1940年首次报道以来,大蒜素因其具有广泛的生物学特性被广泛研究。大蒜素(二烯丙基硫代亚磺酸酯)包括二烯丙基一硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和二烯丙基四硫醚,有天然型大蒜素和化学合成型大蒜素。大蒜鳞茎挤压后产生的蒜氨酸在大蒜素酶的作用下可转化为天然型大蒜素[1];合成型大蒜素主要是采用氯丙烯-硫代硫酸钠-硫化钠法制备。大蒜素可以通过磷脂膜进入生物细胞,并发挥其广泛的药理学特性如抗菌活性[2]、免疫调节[3]、神经保护[4]、心脏保护[5]和抗肿瘤活性[6]等。大蒜素具有多种生物学功能如活血化淤、清热解毒、杀菌抑菌等,广泛地应用于医药、养殖和农业种植等领域。大蒜素是天然的抗菌物质,在动物体内蓄积低,残留少。同时,因为其具有抗菌谱较广,易降解,价格低廉,没有致畸、致癌、致突变的副作用特点,所以可以作为抗生素的替代品和动物饲料添加剂被广泛用于水产和畜牧的养殖及疾病防控等方面。

1 大蒜素的药理作用

1.1 抗菌活性

大蒜素的抗菌活性最早于1944年由Cavallito等[7]提出。因其对多种耐药微生物的抗菌潜力引起了人们的极大关注。大蒜素的抑制和杀灭范围包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等[8],是一种广谱抗菌剂,对水产动物的主要致病菌如肠型点状气单孢菌(Aeromonaspunctataf.intestinalis)、荧光极毛杆菌(Pseudomonasfluorescens)、黏球菌(Myxococcus)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、气单孢菌(Aeromonas)和鲁耶尔森氏菌(MoriRouyere)等都有抑制和杀灭作用。Velliyagounder等[9]研究发现大蒜素对革兰氏阴性牙周病原菌的放线菌(Actinomycetes)有显著抗菌活性,能够减轻由放线菌引起的相关牙齿疾病,在治疗放线菌引起的口腔感染方面发挥着巨大潜力。大蒜素对幽门螺杆菌(Helicoboctonpyloni)也具有抗菌作用。相关体外和体内实验证明,对许多抗生素具有抗性的幽门螺杆菌对相对较低浓度的大蒜素敏感[10]。大蒜素已经被证实对几种人类肺部病原菌具有抗菌活性[11]。更重要的优势在于大蒜素独特的作用机理,大多数细菌对大蒜素不产生抗性。因此,无论大蒜素是单独使用或者是作为抗生素的辅助剂,用于治疗具有药物敏感性和耐药性的结核病都具有广阔的前景[12]。

1.2 免疫调节作用

研究表明,大蒜素具有抑制性的免疫调节作用,其通过刺激免疫细胞的增殖、增强溶菌酶活性以及增强促炎性介质(如γ-干扰素)、促进CD4+ T细胞的扩张等方式来调节外周白细胞的免疫功能[3]。此外,大蒜素还可以通过减少肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的产生来减轻炎症。由于大蒜素对肠上皮细胞具有抑制性免疫调节作用,大蒜素可能具有减轻肠炎症的潜能[13]。在某些情况下,大蒜素或大蒜提取物也可以作为免疫抑制剂来下调炎症反应并抑制T细胞与内皮细胞的相互作用。Feng等[14]发现在啮齿类疟疾模型中,大蒜素通过增强宿主的先天性和适应性免疫反应,来保护宿主免受疟疾感染。同时大蒜素能提高肿瘤患者的细胞免疫功能[15]。由于对多种病原微生物有较好的抑制和杀灭作用,所以大蒜素能提高水产动物的免疫能力,改善水产动物各系统组织的功能,促进水产动物生长[28-32]。

1.3 抗氧化作用

1.4 抗癌作用

大蒜素具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用,因此具有抗肿瘤活性。研究表明其在胃癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌和肝癌等多种肿瘤中发挥抗肿瘤活性。在肝细胞癌中,大蒜素导致p53介导的自噬细胞死亡[21]。在成胶质细胞瘤中,大蒜素通过Bcl-2/Bax的线粒体途径,MAPK/ERK信号传导途径和抗氧化酶系统诱导凋亡[22]。在结肠癌中,大蒜素会增加二倍体DNA含量,并增加从线粒体释放细胞色素C到细胞质的能力,从而导致凋亡性细胞死亡[23]。在胃癌中,大蒜素通过p38丝裂原活化蛋白激酶/caspase-3信号通路抑制增殖并诱导凋亡[24]。

1.5 保护心脑血管作用

大蒜素通过提高抗氧化剂水平,预防高脂血症和心脏肥大,诱导血管舒张,抑制血管生成甚至抑制血小板凝集,在治疗心血管疾病方面具有巨大潜力[25]。大蒜素还可以通过降低活性氧的含量并刺激谷胱甘肽的产生来增强抗氧化剂的状态,从而进一步保护心血管系统。目前的研究表明,大蒜素能有效减轻由急性阿霉素中毒引起的心脏氧化损伤,可用作由抗阿霉素引起的心脏毒性的细胞保护剂[26]。El-Sheakh等[27]研究发现,大蒜素可能通过降低血管氧化应激和相关的炎症(高胆固醇血症诱发的动脉粥样硬化发病机理的基础)来改善高胆固醇饮食喂养的兔子的内皮功能障碍。因此,对于高胆固醇血症患者,适量摄入富含大蒜素对预防血管并发症有益。

2 大蒜素的应用

2.1 大蒜素在水产养殖中的应用

在水产养殖中,大蒜素具有改善饲料适口性,促进食欲,健胃杀菌和驱虫保健等特点,而且无残留,无抗药性,不产生致畸、致癌等毒副作用,是一种安全的新型饲料添加剂[28]。

大蒜素能够促进胃肠蠕动从而促进鱼的生长,同时可以提高饲料采食量和饲料利用率[29],提高水产动物体增重率,还能杀菌和抑菌,提高水产动物成活率,减少发病率,提高水产品肉质。长期饲喂大蒜素的鱼肉质更加鲜美。目前,大蒜素对淡水鱼的促进作用研究比较广泛,如鲤(Cyprinuscarpio)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和罗非鱼(Oreochromismossambicus)等。李会涛等[30]在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)饲料中加入大蒜素饲养6周发现,大菱鲆特定生长率、血清溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力均得到提高,同时发现400 mg/kg的大蒜素能更有效地提高其非特异性免疫力及抗病力。伍莉等[31]研究发现,大蒜素通过提高斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)肠道淀粉酶活力促进鱼体生长。大蒜素还可以改善鱼类的非特异性免疫力从而增强抗病能力[32]。有相关研究表明大蒜素可以减少鱼体组织中铅、镉的积累,从而降低铅、镉中毒[33-34],并且对肝脏纤维性病变也能起到一定的作用。大蒜素还可以预防虹鳟由嗜水气单胞菌引起的相关疾病[35]。大蒜素对罗非鱼和鲤的毛线虫病和陀螺菌病也有抑制作用[36]。大蒜素可通过抑制水生真菌从而防治鱼类的水霉病。同时对水霉菌的孢子有一定的杀灭作用,将其用于养殖水体消毒,可以有效地降低受伤鱼体感染水霉菌的比例和减少因水霉菌的寄生而引起的死亡数量[37]。大蒜素能增强大菱鲆的体质和免疫力,并对预防大菱鲆肠炎病有明显的疗效[38]。

2.2 大蒜素在农业中的应用

大蒜素作为一种植物农药通常被认为是化学农药的理想替代品,其在阳光、空气和高湿度下容易降解,分解为毒性较小或无毒的化合物,因此对非目标生物的危害较小[39]。大蒜素在番茄生产中能激活番茄类植物中的抗氧化酶活性,进而能促进其生长和增加产量[40]。大蒜素还能用于防治番茄疫霉根腐病、胡萝卜链格孢黑腐病、稻瘟病、黄瓜枯萎病和柑橘类由青霉菌种引起的腐烂[41]。大蒜素作为一种具有广谱抗性的植物农药,具有良好的应用前景。

3 大蒜素的提取技术

3.1 水蒸气蒸馏

水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入提取物中,使目标物随水蒸气一起蒸馏出来的一种浸提方法。该方法设备简单、操作方便、成本相对较低和易于推广,是常用的一种提取方法。但是水蒸气蒸馏法不适合提取热敏性化合物,提取率较低,提取物中的有效成分不易分离。仇小艳等[42]以大蒜挥发油提取率为指标,通过单因素和L9(34)正交试验确定了水蒸气蒸馏法提取大蒜素的最佳提取工艺及条件。

3.2 溶剂提取法

溶剂萃取法是利用单一有机溶剂或几种有机溶剂混合作为提取剂,将目标化合物提取出来的一种常用方法。有机溶剂萃取法设备简单、操作便捷、提取率相对于水蒸气蒸馏提取法高,应用更加广泛。溶剂提取通常和超声辅助提取、微波辅助萃取相结合。根据大蒜素溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚等有机溶剂的特性,通常情况下采用的提取试剂为甲醇、乙醇、丙酮、正己烷或这些溶剂的混合物。孙艳等[43]以大蒜素的提取率为指标,通过单因素试验和正交试验,确定有机溶剂提取大蒜素的最佳提取工艺：大蒜泥在40 ℃下酶解80 min后,按料液比为1∶4加入95%的乙醇,温度为25 ℃时萃取大蒜提取物100 min。康平利等[44]采用微波萃取技术提取大蒜素中的大蒜新素,同时对萃取条件进行优化,得出微波萃取的最佳条件：二氯甲烷为萃取剂,用量控制在200 mL,萃取时间为30 s。

3.3 超临界CO2萃取

超临界CO2萃取技术作为一种新兴萃取技术备受关注。在超临界相中,CO2具有气体和液体性质,并且具有良好的溶解能力。随着压力的增加,超临界CO2的密度增加,因此可以通过改变压力来调节其溶解能力。超临界CO2提取具有提取率高、提取温度低的优点,因此特别适合提取大蒜素,但所得大蒜素纯度低,需要进一步纯化,而且超临界CO2萃取需要精密的仪器,成本相对较高,无法满足一般实验室的要求。梁兵等[45]在超临界条件下,研究用CO2作萃取剂从大蒜中萃取大蒜油的工艺条件(温度、压力、萃取剂用量)对大蒜油提取效率的影响,结果表明,超临界CO2萃取最佳工艺及条件为温度35～40 ℃,压力15 MPa,萃取剂用量5～6 L/h·g,大蒜油的回收率为0.1%。

3.4 分子蒸馏技术

分子蒸馏(Molecular distillation,MD)的纯化原理基于各种分子平均自由距离的不同,是一种应用于液体分离的先进技术,由于其操作和蒸馏温度低,可长时间加热和无污染。因此,MD特别适用于热敏性物质的分离。Liang等[46]首先通过超临界CO2萃取获得大蒜素后利用分子蒸馏对其进行纯化,同时研究了绝对压力、蒸馏温度和进料流速等操作条件对大蒜素纯度和回收率的影响。

4 大蒜素的检测技术

4.1 定硫检测法

定硫法利用大蒜素中含有的硫代亚砜基被浓硝酸氧化成硫酸离子,与氯化钡反应形成硫酸钡沉淀,根据硫酸钡的重量换算出大蒜素的含量。马往校等[47]采用定硫法测定苍山大蒜中的大蒜素含量,同时对氧化剂用量、酸度及称样量等因素进行优化,确定了定硫法测定大蒜素含量的最佳条件。与硝酸汞法进行比较,经t-检验,两种方法间不存在显著性差异。

4.2 分光光度法

根据大蒜素能够与某些化合物发生反应而显色的特性可以采用分光光度法检测。大蒜素能与半胱氨酸定量反应,然后利用二硫代二硝基苯甲酸测定过量的半胱氨酸,从而间接测得大蒜素的含量。Talia等[48]利用商品化生色硫醇4-巯基吡啶,通过分光光度法测定大蒜素的含量。唐辉等[49]建立4-巯基吡啶紫外分光光度法测定大蒜素总量。但这类测定方法只能够测定大蒜素总量,对每种分解物质的具体含量仍需要有效的分离和检测手段。

4.3 气相色谱法

潘浩等[50]采用气相色谱(GC)法研究了以7.5 mg/kg(体质量)单次剂量口灌给药后,大蒜素在鲫(Carassiusauratus)体内的药物代谢动力学及药物残留消除规律。宫玲玲等[51]以苯乙酮为内标利用气相色谱法测定饲料添加剂大蒜素的含量。但是气相色谱法受温度的影响,采用气相色谱-氢火焰检测器测定大蒜素时温度不能太高。一些研究表明：当程序升温较慢、柱温较低、进样温度较低时,检测到的降解产物以二烯丙基硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基甲基硫醚、烯丙基甲基二硫醚和烯丙基甲基三硫醚等为主;而当程序升温较快、柱温较高、进样温度较高时,检测出的降解产物主要是二硫杂环-己烯衍生物,其次是各种硫醚和硫代亚磺酸酯,其中二烯丙基三硫醚和二硫醚的含量高[52]。因此采用气相色谱法测定大蒜素时温度不能过高。

4.4 高效液相色谱法

大蒜素的紫外线发色团吸收较弱,因此采用HPLC方法时检测灵敏度相对较差。Sankhadip等[53]采用高效液相色谱-紫外检测器测定大蒜素的含量。色谱柱为kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相由甲醇-水(v/v,50∶50)组成,流速为0.5 mL/min,UV检测器波长设置为254 nm。Liang 等[54]利用高效液相色谱法测定双层片剂中的大蒜素。色谱柱为C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相由甲醇-0.4%甲酸(v/v,65∶35)组成,流速为1 mL/min,UV检测波长设定在242 nm。李齐欢等[ 55]运用高效液相色谱法以kromasil C18为色谱柱,甲醇-水-甲酸(v/v,85∶15∶0.1)为流动相,流速为0.8 mL/min,紫外检测波长为252 nm,测定了大蒜素胶囊中二烯丙基三硫醚的含量,结果表明本法快速、准确、灵敏,对实现大蒜素胶囊的质量监控具有重要意义。徐丽红等[56]选取了固体类、液体类和半固体类3类保健食品为研究对象,运用液相色谱法对其中大蒜素的主要功效成分二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚进行了测定,并对提取溶剂、乙醇体积分数、提取温度和色谱柱类型进行了优化分析。同时将HPLC和GC分析进行比较,结果无明显差异。张文斌等[57]建立了HPLC测定大蒜油胶丸中主要有效成分二烯丙基三硫醚的方法,该方法只需要普通的ODS柱,进样量少,样品不需特殊处理,准确性好,灵敏度高,是测定原大蒜油及其胶丸中二烯丙基三硫醚较为理想的方法,对于控制产品的质量也具有重要意义。许珂珂等[58]利用高效液相色谱法测定鲜蒜中大蒜素二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚的含量。以C18柱(4.6×250 mm,5 μm)为色谱柱、乙腈-水(v/v,75∶25)为流动相,紫外检测波长为215 nm,方法学指标良好,适用于鲜蒜产品提取与检测。

4.5 色谱联用法

色谱联用法相较于单纯的气相色谱和液相色谱法在准确度和灵敏度上有显著的优势。大蒜素的测定中常采用的是气相色谱-质谱联用(GC-MS)法。王建等[59]采用GC-MS法测定大蒜油及其软胶囊中二烯丙基三硫醚等大蒜素的含量。针对目前尚无大蒜油软胶囊有关产品标准和检测方法的现状,利用GC-MS检测方法可以对大蒜油及以大蒜油为原料生产的大蒜油软胶囊中的硫醚类化合物进行定性分析和定量测定。郑屏等[60]采用GC-MS法对天然大蒜油和合成大蒜素的成分进行分析和鉴定,研究其主要组分及分布情况。通过对两者质谱图的比较,发现在合成的大蒜素中含有氯丙烯,以此判断实际大蒜油样品中是否含有合成大蒜素。康平利等[44]建立了用微波萃取技术提取大蒜中大蒜油的方法,并运用气相色谱-质谱分析方法对提取物中的大蒜新素进行测定,结果表明,该方法具有快速、萃取剂用量少、精度好、回收率高、准确可靠等优点,并通过对萃取条件的选择,得出二氯甲烷为微波萃取大蒜油的最佳萃取剂。郭晓斐等[61]采用改进的水蒸气蒸馏法从大蒜中提取挥发物,运用气相色谱-质谱技术对大蒜油进行定性分析,共鉴定出20种物质,并用面积归一化法对各物质的相对含量进行测定,结果表明含硫化合物约占挥发油总成分的95%以上,其中大蒜新素约占挥发油总量的三分之一,含量最高。

由于烯丙基硫化物弱极性难电离,因此利用液相色谱-质谱联用法测定大蒜素含量的研究报道很少。李来生等[62]以AgNO3诱导使二烯丙基硫化物离子化,通过正离子模式测试较好实现了使用液相色谱-质谱联用法检测大蒜素,但是该方法缺乏普适性。

利用色谱及质谱检测技术测试大蒜素的参数指标如表1。

表1 大蒜素色谱及质谱检测技术参数指标对比表Tab.1 Comparison of parameters of allicin chromatography and mass spectrometry

4.6 其他方法

大蒜素的检测方法还有硝酸汞滴定法。该方法的原理是利用大蒜素分子中含有的硫能与硝酸汞形成沉淀测定大蒜素的含量。该法操作相对繁琐。周重阳等[63]利用大蒜素具有抗菌作用这一特点,建立了大肠杆菌生物法测定大蒜油中大蒜辣素和大蒜新素含量的方法。方法简便易操作,并与化学方法检测结果具有一致性。

随着对大蒜素的药理作用机制的不断深入研究,大蒜素的应用将更加广泛,其提取效率更加高效,产品加工方式不断创新。对大蒜素成分及低含量残留检测技术的要求也会相应提高。随着现代高分辨质谱的普遍应用,检测技术将会更加精确、快速和高效。