滕元旭，骆 霞，张雪蒙，崔辉梅

(1. 石河子大学农学院，新疆 石河子 832003; 2. 特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832003)

新疆是我国加工番茄的主要生产地，其产量占到全国总产量的一半以上[1]，但是新疆特殊的地理气候条件容易造成土壤盐渍化[2]。盐渍化会使土壤溶液的浓度过高，导致植物吸收水分和养分的能力下降，活性氧物质在体内的稳态失衡,破坏细胞膜的完整性，增加电解质的渗出率，影响植物的光合作用进而影响植物正常的生长发育[3-6]。因此，提高加工番茄的耐盐性，对促进新疆“红色产业”发展，增加农民收入，维持加工番茄市场稳定及促进农业增产增效具有重要的现实意义和战略意义。

一氧化碳(CO)是一种常见的双原子稳定气体分子。研究表明，植物体内的CO是由血红素加氧酶催化血红素产生的[7-8]，而高铁血红素是一种天然血红素的体外纯化物，其化学性质与天然血红素相似[9]，应用高铁血红素可以显著上调HO1(血红素加氧酶1)的转录和活性[10]，因此高铁血红素被用作外源信号分子CO的供体。CO在植物对非生物胁迫的响应中发挥积极作用[11]，高铁血红素通过提高HO的活性，降低银离子的积累和增强抗氧化防御系统，降低了AgNPs胁迫对芥菜的伤害[12]。Chen等[13]发现，CO通过降低Zn的吸收，提高水稻对锌的耐受性。牟雪姣等[14]发现，CO处理可以提高黄瓜种子渗透调节能力和相关同工酶的表达，增强了植株对干旱胁迫的适应性。袁星星等[15]通过对盐胁迫下小麦的研究发现，CO预处理可以抑制脯氨酸脱氢酶活性，缓解小麦在盐胁迫下受到的伤害。

近年来有研究表明CO已经被作为除NO外的另外一种气体信号转导分子，与H2S气体分子一起参与植物体的多种生理代谢调控[8,16-17]，目前关于NO[18-19]和H2S[6]缓解盐胁迫的机理研究已经越来越全面,而关于外源CO诱导加工番茄抗(耐)盐性的光合生理、相关光合荧光参数及渗透性调节物质变化的研究尚缺乏深入报道。本试验以不同品种加工番茄为材料，研究外施不同浓度CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗叶片光合生理及相关生理指标的影响，探讨外施CO调控NaCl胁迫下加工番茄生长的生理生化机理，为利用化学诱抗剂缓解盐胁迫提供理论依据，为提高新疆盐碱地区加工番茄的产量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以加工番茄品系KT-7为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄幼苗培育 于2020 年5—7月石河子大学农学院试验站进行试验，选取籽粒饱满、大小均一的加工番茄种子，采用10%的高锰酸钾消毒，并用蒸馏水冲洗3次后，放于(25±1)℃的恒温培养箱内催芽3 d，播种于温室72 孔穴盘中，穴盘基质为蛭石。待叶片长到第一片真叶展平时，每天下午浇50% Hoagland营养液，待长到四叶一心时选取长势一致的幼苗移栽至100% Hoagland营养液中缓苗3 d后进行处理。

1.2.2 胁迫处理 预试验:筛选NaCl处理和高铁血红素处理浓度，对四叶一心的加工番茄幼苗分别进行处理。NaCl共设2个浓度，分别为100 mmol·L-1和150 mmol·L-1，以Na100和Na150表示；每个NaCl浓度下分别设4个高铁血红素梯度(0、0.010、0.025、0.050 mmol·L-1，分别以Na100、Na100H1、Na100H2、Na100H3和Na150、Na150H1、Na150H2、Na150H3表示)，以Hoagland营养液配置成处理液，以无NaCl和高铁血红素的Hoagland营养液培养作为对照(CK)。并于每日9∶00对各处理植株叶面喷施高铁血红素(CO供体)，每株幼苗喷施量约为10 mL，每个栽培槽种植5株作为1个重复，4次重复，随机排列。盐处理3 d后测定加工番茄第4片叶的净光合速率(Pn)、丙二醛含量和相对电导率，测定重复3次。

根据预试验的筛选结果设置以下4个处理，分别为CK,Na150,Na150H1,Na150H2(后2个处理下文分别简写为H1、H2)，施用处理方式同预试验，处理3 d后测定加工番茄第4片叶的光合参数、叶绿素荧光参数，取样测定每个处理第4片叶的各项生理指标，测定重复3次。同时测定植株的生长指标。

1.3 指标测定方法

1.3.1 形态指标测定 盐处理3 d后用直尺测定加工番茄幼苗的株高，使用游标卡尺测定茎粗，幼苗用自来水冲洗干净后吸干表面水分称鲜质量，然后在烘箱中105℃杀青30 min，70℃烘干至恒重，称干质量。按如下公式计算壮苗指数：壮苗指数=(茎粗/株高)×全株干质量×100%。

1.3.2 光合色素含量、光合参数测定 叶绿素提取采用高俊凤[20]方法(95%乙醇提取法)。光合特性测定采用LI-6800便携式光合测定系统(Li-Cor Inc.，Lincoln，NE，USA)于处理结束当天10∶00—12∶00进行测定。测定前将试验植株提前30 min摆放在阳光下进行充分光适应，每个处理选择3株，测定加工番茄第4片叶片的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)。计算以下指标：表观CO2利用效率(CUEapp)=Pn/Ci。

1.3.3 快速叶绿素荧光动力学曲线测定 参考Goussi等[21]方法，测定前将叶片暗适应30 min，然后利用植物效率仪(M-PEA，Hansatech英国)测定各处理加工番茄叶片的快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP曲线)。计算如下指标：

VOP，指叶绿素a荧光瞬变在两个荧光极端相位O(F0)和P(Fm)之间双重归一化：

VOP=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)

VOK，指叶绿素a荧光瞬变在步骤O和K之间双重归一化：

VOK=(Ft-Fo)/(FK-Fo)

VOJ，指可变荧光瞬变在步骤O和J之间双重归一化：

VOJ=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)

ΔVOK=VOK(处理)-VOK(CK)

ΔVOJ=VOJ(处理) -VOJ(CK)

VOI，指可变荧光瞬变在Fo和FI阶段之间双重归一化：

VOI(≥1)=(Ft-Fo)/(FI-Fo)

VIP，指可变荧光瞬变在步骤I和P之间双重归一化：

VIP=(Ft-FI)/(Fm-FI)

1.3.4 JIP-Test分析 根据Goussi等[21]的方法对OJIP曲线所得参数进行计算，所需参数如下：(1)荧光参数：Ft为某时刻的荧光，Fo(20 μs时荧光，O相)、FK(300 μs时荧光，K相)、FJ(2 ms时荧光，J相) 、FI(30 ms时荧光，I相)、Fm(最大荧光，P相);(2)CS(单位受光面积)、RC(单位PSⅡ活性反应中心)，反应中心密度：RC/CSm；(3)ABS(光能吸收量)，TRo(捕获的光能)，ETo(用于电子传递的能量)，DIo(热耗散的能量)。基于单位面积和反应中心的比活性参数：单位面积吸收光能(ABS/CSm)、捕获(TRo/CSm)、用于电子传递(ETo/CSm)和热耗散(DIo/CSm)的光能；单位反应中心吸收(ABS/RC)、捕获(TRo/RC)、用于电子传递(ETo/RC)及热耗散(DIo/RC)的能量；(4)量子产额：最大光化学效率φPo(TRo/ABS)、用于电子传递的量子产额φEo(ETo/ABS)、用于热耗散的量子比率(DIo/ABS)；反应中心捕获的激子中用来推动电子传递到电子传递链中超过QA的其他电子受体的激子占用来推动QA还原激子的比率(Ψo)；叶绿素反应中心密度RC/ABS、性能指标PIABS和表现指数PICSM。

1.3.5 渗透调节物质含量测定 采用李合生[22]的蒽酮比色法、考马斯亮蓝法和磺基水杨酸法分别测定幼苗叶片中可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量。

1.3.6 丙二醛含量和相对电导率测定 采用李合生[22]的2-硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量；电导率仪测定相对电导率。

1.3.7 叶片相对含水率测定 每处理各取3片第四叶叶片，称取鲜重(Fw)后置于蒸馏水中浸泡2 h，用滤纸吸干水分，称其饱水重(Tw)，放入烘箱中105℃杀青15 min后，75℃烘干到恒重，称取干重(Dw)。相对含水率RWC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)。

1.4 数据处理

所有指标测定重复3次，使用Microsoft Excel 2019进行相关数据的统计记录，采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法多重比较(P<0.05)。采用OriginPro 2021绘制柱状图和折线图。

2 结果与分析

2.1 NaCl和外源CO对加工番茄处理浓度的确定

与CK相比，随着盐浓度的上升，加工番茄幼苗处理3 d后叶片的Pn显著下降，相对电导率和MDA含量显著上升(图1)，在100 mmol·L-1的盐浓度下随着CO施加浓度的上升，Pn先上升后下降，相对电导率和MDA含量显著下降；在150 mmol·L-1的盐浓度下施加不同浓度CO均会造成Pn的显著上升，相对电导率和MDA含量显著下降。另外从幼苗表型观察，100 mmol·L-1NaCl处理盐害表现并不明显，0.010、0.025 mmol·L-1的CO处理对其产生明显的缓解效应。因此，本试验选用150 mmol·L-1NaCl作为盐胁迫的浓度，高铁血红素浓度选用0.010 mmol·L-1和0.025 mmol·L-1。

注：图中不同小写字母表示差异显著水平(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant level of difference (P<0.05).图1 不同浓度NaCl和外源CO处理对加工番茄幼苗叶片净光合速率、相对电导率和丙二醛含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of NaCl and CO treatments on net photosynthetic rate, relative electrical conductivity and malondialdehyde (MDA) content of processed tomato seedling leaves

2.2 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗干物质积累量的影响

由表1可知，与CK相比，单独盐胁迫下加工番茄株高、茎粗、生物量和壮苗指数显著降低，降幅分别为22.56%、18.83%、35.04%、32.12%。外施CO处理显著提高了盐胁迫下幼苗的株高、茎粗、生物量和壮苗指数，与Na150相比，H1的增幅分别为24.23%、14.56%、34.78%、24.67%，H2的增幅分别为15.21%、10.16%、25.38%、20.20%，均达到显著性差异。

表1 外源CO对盐胁迫下加工番茄幼苗形态指标的影响Table 1 Effects of CO treatments on the growth of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.3 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗叶片光合色素含量的影响

由表2可知，与CK相比，单独盐胁迫显著降低了加工番茄幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量。外源CO处理提高了盐胁迫下幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量，与Na150相比，H1处理分别提高了为10.58%、19.52%、12.67%、5.75%，叶绿素a/b降低了7.75%；H2处理分别提高了11.31%、19.92%、13.33%、8.51%，叶绿素a/b降低了7.33%。

表2 外源CO对盐胁迫下加工番茄幼苗光合色素的影响Table 2 Effects of CO treatments on photosynthetic pigment of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.4 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗叶片光合气体交换参数的影响

表3表明，与CK相比，单独盐胁迫下加工番茄Tr、Pn、Gs、CUEapp指数显著降低，降幅分别为70.78%、72.11%、83.48%、69.73%。外施CO处理显著提高了盐胁迫下的Pn和CUEapp，与Na150相比，H1的增幅分别为87.24%和152.58%，H2的增幅分别为75.62%和130.49%；外施CO显著降低了Ci，H1和H2处理分别降低了26.71%和25.28%。

表3 外源CO对盐胁迫下加工番茄幼苗光合气体交换参数的影响Table 3 Effects of CO treatments on photosynthetic parameters of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.5 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗快速叶绿素荧光的影响

由图2可知，与未处理(CK)幼苗相比，盐胁迫下的加工番茄幼苗叶绿素快速荧光曲线产生了一定的变化。未处理(CK)叶片的Ft表现出典型的OJIP瞬态(图2A)，在150 mmol·L-1NaCl处理3 d后，Fm和Fo与CK相比有较大程度的降低，分别降低了20.86%和24.20%；与Na150相比，当施加外源CO时Fm和Fo无明显变化。与CK相比，盐胁迫降低了加工番茄的OJ期，此外，JI和IP后段在盐胁迫下荧光变化幅度减小。为了更好地分析瞬时叶绿素荧光，在Fo处进行了一阶归一化(Ft/Fo)(图2B)，显示了典型的O、J、I和P步骤。与CK相比，盐胁迫下加工番茄叶片可变荧光提高，在外源施加CO后，相较Na150，叶片可变荧光进一步提高。为了避免不同的Fo和Fm值产生的任何干扰和异质性，对Fm处的荧光值进行了第二归一化步骤(图2C)，得到相对可变荧光(VOP)；NaCl处理3 d后，VOP发生了改变，荧光升高趋势相对于CK在0.2 ms至1 ms时变缓。

分别对O到P瞬变的主要波段进行微分曲线处理:L波段(O-K)和K波段(O-J)。这些波段的曲线是用未处理(CK)和受到盐胁迫的植株之间归一化瞬变的差异绘制的(图2E、图2G)。由图2E可知，ΔVOK显示盐处理植株会出现一条负带(L带)，与盐胁迫下的植株相比，外源施加CO会使L-带的振幅逐渐减小。ΔVOJ的动力学差异揭示了在NaCl处理的植株中出现的所谓的K-带，它在300 μs时VOJ之间出现一个峰值(图2G)。处于盐胁迫下的植株K-带均呈现负偏差，与盐胁迫下的植株相比，H1处理会使K-带的振幅逐渐增大。

针对I-P相的测量，对在30～300 ms时间范围内荧光瞬变VOI和在30～200 ms时间范围内进行瞬时VIP归一化处理。不同处理间的荧光VOI差异显著(图2H)。与CK相比，盐胁迫下的植株的VOI略有上升。同时VIP变化与其几乎相似但差异不明显(图2I)。

图2 外源CO对盐胁迫下加工番茄幼苗叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)的影响Fig.2 Effects of CO treatments on the fast induction curves of chlorophyll a fluorescence(OJIP) in leaves of processing tomato seedlings under NaCl stress

2.6 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗JIP-test参数的影响

对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的信息进行数学解析，可以得到多个荧光参数。为了表征处理下加工番茄幼苗PSII的状态，根据叶绿素荧光曲线得出JIP-test参数并制成雷达图(图3)。其中以CK为参考对每个变量进行归一化处理。

图3 外源CO对盐胁迫下加工番茄幼苗JIP-test参数的影响Fig.3 Effects of exogenous CO on JIP-test parameters of processing tomato seedlings under NaCl stress

以有活性的反应中心(RC)为基础，在盐胁迫下，单位有活性反应中心吸收的光能(ABS/RC)、捕获的光能(TRo/RC)、热耗散的光能(DIo/RC)以及电子传递的能量(ETo/RC)显著降低，说明胁迫时叶片减少了用于电子传递的能量份额，反应中心RC活性降低，而外源喷施高铁血红素会使ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC、ETo/RC的数值下降，其中H1处理缓解效果更明显,与盐胁迫相比分别降低了6.59%、6.12%、8.67%、1.37%，H2处理效果不明显。对叶片受光单位面积(CSm)来说，在盐胁迫下活性反应中心密度(RC/CSm)、单位面积吸收(ABS/CSm)、捕获(TRo/CSm)、传递(ETo/CSm)和单位面积热耗散(DIo/CSm)的能量明显降低，而外源喷施CO后RC/CSm和ETo/CSm有小幅的升高，其中H1处理缓解效果更明显,与盐胁迫相比分别提高了12.40%和6.02%。

与CK相比，盐胁迫下的叶绿素反应中心密度RC/ABS、性能指标PIABS和表现指数PICSM分别增加了21.55%、31.33%和2.57%，与盐胁迫相比外源施加CO会进一步提高RC/ABS、PIABS和PICSM，其中H1处理更为明显，分别提高了7.04%、6.25%和11.57%。

2.7 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗叶片渗透性调节物质的影响

表4表明，单独NaCl处理会显著降低加工番茄幼苗的叶片相对含水率，相比于CK降低了15.72%，显著提高脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量，相比于CK分别提高了377.58%、119.23%、47.35%。外施高铁血红素处理显著提高了盐胁迫下的叶片相对含水率，与Na150相比，H1和H2处理分别提高了10.39%和9.56%；降低了盐胁迫下的叶片脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量，其中H1分别降低了40.16%、25.18%、4.36%，H2分别降低了28.41%、18.75%、8.75%。

表4 外源CO对NaCl胁迫下加工番茄幼苗 叶片生理指标的影响Table 4 Effects of CO treatments on some physiological indexes of processing tomato seedlings under NaCl stress

3 讨 论

盐胁迫对植株的伤害是多方面的，会对植物造成渗透胁迫、离子胁迫和氧化胁迫[23-24]，本研究发现150 mmol·L-1NaCl胁迫，破坏了加工番茄幼苗细胞膜结构的完整性，导致相对电导率的增加，进而限制植物的正常生长发育。喷施0.010 mmol·L-1高铁血红素会提高渗透性调节物质(可溶性糖、可溶性蛋白)的含量，缓解渗透胁迫，从而降低电解质渗出率和丙二醛含量，提高干物质的积累，降低盐胁迫对加工番茄的伤害,这与袁星星等[15]对外源CO处理下小麦幼苗耐盐性中的研究结果一致。

植物光合作用的能量主要源自光合色素捕获的光能，光合色素含量在很大程度上反映出植物叶片的光合能力。其中类胡萝卜素Car作为植物体内重要的抗氧化剂，是光吸收复合体的重要组成部分，可以有效减轻活性氧对光合结构的破坏[25-26]。本研究表明盐胁迫使加工番茄叶片中Chl a、Chl b、Chl (a+b)的含量降低，外源CO处理提高了叶片光合色素含量，有效缓解盐胁迫对加工番茄幼苗的伤害，提高加工番茄光合能力。

盐胁迫下叶片光合同化速率的降低是盐胁迫抑制植物生长重要因素之一[27]。本试验表明NaCl胁迫会导致番茄幼苗叶片Gs显著降低，导致Pn和Tr的降低，试验结果与郑州元等[6]在盐胁迫番茄中研究结果相同，本试验结果还表明外源CO供体会显著提高加工番茄叶片的Tr和Gs，提高叶片的CUEapp，提高NaCl胁迫下番茄幼苗叶片对CO2和光能资源的综合利用效率，改善并提高叶片的光合性能，从而缓解盐胁迫对加工番茄叶片光合作用的限制，提高植物抗性。

叶绿素荧光主要来源于在PSⅡ中的叶绿素a，几乎所有的光合过程变化都会通过叶绿素荧光反映出来。近年来诸多研究显示盐胁迫能引起植物产生复杂的生理生化反应，对植物叶绿体的光合器官造成伤害, 使PSII反应中心受损[28-30]，高盐度和长时间的盐胁迫可能会使从天线复合体到PSII反应中心的激发能量转移增加而导致Fo的显著下降。高盐度使电子转移到PSII受体一侧的效率受到了抑制从而降低Fm[31]。快速叶绿素荧光诱导动力学曲线包含了大量关于PSⅡ反应中心原初光化学反应的信息，通过对曲线中各个参数的分析可以深入了解环境条件对光合机构(主要是PSⅡ供体侧、受体侧和反应中心)的影响[32],其曲线中的O、J、I、P相表现出明显差异的荧光参数，可以反映盐胁迫对植物PSII的伤害情况[21]。

本研究结果表明盐胁迫会降低Fo和Fm，导致光合作用受到抑制。同时在针对不同阶段叶绿素荧光时，O-J、J-I和I-P步骤随着盐胁迫下不同浓度的CO处理改变，其中ΔVOK和ΔVOJ的变化代表了外源喷施CO后在盐胁迫下加工番茄可以更好地激发能量利用效率，缓解氧复合体(OEC)损伤和PSII供体光抑制，使叶绿体有更好的系统稳定性。另外根据对活性反应中心RC和受光单位面积CSm来看，ABS/RC、ABS/CSm等参数明显降低，可能归因于活性反应中心天线尺寸的增加，此结果与Goussi等[21]在拟南芥中的研究中5 d时中等盐胁迫下的结果相同，这表明PSII活性反应中心的稳定性与植物对盐胁迫反应有关；而本研究中外源施加CO处理H1与其低盐胁迫5 d下趋势一致，外源CO对盐胁迫下加工番茄受到的伤害有缓解作用，因此认为外源CO可能是通过提高活性反应中心天线尺寸和稳定性来缓解盐胁迫对光系统的伤害。此外本研究认为盐胁迫下加工番茄性能参数(PIABS)的提高是由于植物抵御盐胁迫时产生了自我保护机制，且外源施加CO可以进一步提高自我保护机制的效果，缓解盐胁迫对加工番茄的伤害。

4 结 论

对盐胁迫下加工番茄外源施用CO可以通过提高活性反应中心天线尺寸和稳定性，更好地激发能量利用效率，缓解盐胁迫对PSⅡ反应中心的损伤，激活自我保护机制(叶绿素含量提高、渗透性调节物质积累)，降低盐胁迫对植物细胞的损伤(MDA、相对电导率降低)，提高叶片的光合能力(Pn上升)，缓解盐胁迫对加工番茄叶片光合作用的限制，增加干物质积累，进而提高植物抗性，有效缓解胁迫对加工番茄幼苗生长的抑制。