田茂秀，高雅莉，岑小妹，田茂靖，黄国旅，莫子洪，兰文明，吴丽娜

(1.广西壮族自治区国有七坡林场，广西 南宁 530000；2.广西壮族自治区国有钦廉林场，广西 钦州 535000)

1 引言

马尾松作为我国主要造林树种，对于马尾松林的多目标经营是当前林业可持续发展及林分质量健康发展的关键。马尾松成熟林具有丰富的林下植被以及一定的隐蔽度，马尾松林下套种中草药是实现其多目标经营的重要途径[1，2]。五指毛桃属于桑科榕属植物粗叶榕的干燥根，又被称为南芪或五爪龙，是岭南少数民族地区常见的一种民间用药，为药食同源佳品，具有“广东人参”的美誉。五指毛条性平味甘，具有祛痰平喘、健脾补气、舒筋利湿的效用，常用于肺痨咳嗽、无力少食、浮肿脾虚、肝胆湿热等病症[3]。现今，我国五指毛桃人工种植尚未形成规模，五指毛桃的主要来源仍是野生采集。在五指毛桃市场需求量日益增长的背景下，野生五指毛桃受到掠夺式挖掘，致使野生资源出现枯竭，对自然生态环境带来极大压力。从生态角度来看，五指毛桃是小乔木，多生长在海拔500～1000 m的疏林、灌丛山谷、林源等温暖湿润的地方，具有一定的耐阴性。

林—药种植模式要实现对林地资源的充分利用，通过多层次立体结构提升空间利用率和光能利用率，改良土壤肥力及理化性质，从而实现对生态环境的改善，构成良性循环[4，5]。李娟[6]针对橡胶林下终止五指毛桃进行研究，通过科学是非的手段，不仅使五指毛桃得到良好生长，且有利于橡胶树胶乳的增产。傅志真[7]针对马尾松林下种植千年桐的存活率及幼苗生长指标进行分析，郁闭度在0.3时，苗木粗壮，有利于苗木的后续生长，可采用挖穴结合施肥的技术促进千年桐的生长。而倪乐[8]针对不同树种套种模式下雷公藤甲素含量的动态变化、林地土壤养分分析等，得到厚朴林下套种雷公藤可使雷公藤叶和根中的雷公藤素得到增加，并提升林地土壤中的总氮含量。而目前有关马尾松下种植五指毛桃的研究较少，马尾松能够为林下植被提供良好的荫蔽环境，适宜五指毛桃的林下种植[9]。由此，对于马尾松林下种植五指毛桃展开研究，可对不同年限五指毛桃的生长性状和主要活性成分含量进行综合分析，为马尾松林下五指毛桃的规模种植提供最佳采收期指导。

2 材料与方法

2.1 试验地概况

试验地选择为七彩七坡林下经济产业示范区马尾松天然林。研究地所在区域为亚热带季风区，地理坐标为108°12′E，22°42′N，海拔100～300 m，降雨充足，日常充分，年均降雨量1472.3 mm，平均气温21.8 ℃。雨季主要集中在4～9月份，无霜期较长。试验地是丘陵地貌，坡度25°，土层较厚，土壤多为红壤，具有丰富的腐殖质含量，肥力较好。

2.2 试验材料

2.2.1 供试种苗

供试的五指毛桃种苗采购于广西南药康园投资有限责任公司。

2.2.2 仪器与设备

试验主要用到的仪器与设备如下：昆山市超声仪器有限公司生产的KQ-500DE超声波清洗器和e2695高效液相色谱；waters Symmetry C18色谱柱；上海力辰邦西仪器科技有限公司生产循环水式多用真空泵，型号为SHZ-DⅢ；Milli-Q超纯水制备仪，由美国Millipore公司生产；Basis Hei-VAP HL旋转蒸发仪，由德国海道尔夫公司生产[10～12]。

2.2.3 仪器与设备

试验所用到的主要试剂包括：99.37%标准佛手柑内酯，由马斯特生物科技有限公司提供；99.6%标准品补骨酯素，由中国药品生物制品鉴定所提供；水为超纯水。

2.3 试验设计

于2018～2021年每年3月份在试验基地中划区种植五指毛桃，以移栽时的小苗作为CK。采用的种植密度为60 cm×60 cm，离松2 m，开穴规格为15 cm×25 cm，并将2 kg充分腐熟的有机肥与细土混匀后作为基肥在穴内施用。移栽过程要保证移栽地的生长环境、种植和管理方法均相同[13]。在2022年2月记录五指毛桃生长情况，对其中佛手柑内酯与补骨酯素的含量进行测定。

2.4 指标及方法

2.4.1 植物学性状测定

各生长年限的五指毛桃选择10株作为样品进行测定，保证样品的大小均匀、根茎叶齐备[14]。对于马尾松林下种植五指毛桃植物学性状的测定主要包括：株高、根长、基径、最大根径、侧根数、地上部与地下部鲜(干)重等。地上部与地下部鲜(干)重的测定方法如下：将五指毛桃鲜样放置在105 ℃的烘箱中进行30 min的杀青处理，后调整温度至55 ℃烘干至恒重后进行称重[15，16]。取测量平均值进行数据分析。

2.4.2 化学成分含量测定

将经过烘干处理的五指毛桃样品过40目筛，检测其中的佛手柑内酯及补骨酯素含量。

(1)标准品溶液的制备。称取3.7 mg的佛手柑内酯标准品与17.75 mg的补骨酯素标准品，在其中加入甲醇，利用超声处理使其溶解，分别制备成1.775 mg/mL的补骨酯素标准品以及0.37 mg/mL的佛手柑内酯标准品。

(2)样品溶液的制备。将处理好的五指毛桃样品粉末称取出0.5 g，将其与10 mL甲醇共同放入50 mL的锥形瓶中，经过30 min后的超声提取，再定容至10 mL，利用0.45 μm的滤膜进行过滤操作。

(3)检测波长的确定。将制备好的两种标准品溶液经过紫外全波长扫描，将最大吸收峰作为试验检测波长[17]。

(4)色谱条件。Waters Symmetry C18色谱柱为4.6 mm×250 mm，5 μm的规格；流动相为60∶40的甲醇—水；柱温35 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

(5)绘制标准曲线。用流动相溶液稀释佛手柑内酯和补骨酯素标准品溶液，分别制备出1.775、3.55、7.1、14.2、28.4与56.8 mg/L的梯度溶液，在上述色谱条件下进行测定。绘制标准曲线，横纵坐标分别为标准品溶液浓度及峰面积[18]。

(6)检验稳定性。完成样品的制备后，分别在0、1、2、4、8、12 h取样进行稳定性检验。

(7)验证试验用检测方法。称取浓度相同的标准品溶液进行重复的5此检测，保证检测方法具有良好的精确程度。之后对同批次的样品溶液进行称取，制成待测样品，测定其中主要活性成分，以此对检测方法的重复性进行检验。最后，同样称取同批次的5份样品，在其中加入0.1875 mg/mL的佛手柑内酯标准品及0.8875 mg/mL的补骨酯素标准品各1 mL，制备样品溶液，对佛手柑内酯及补骨酯素的含量进行测定，计算加标回收率。

3 结果与分析

3.1 样品中五指毛桃药用活性成分的测定方法确定

试验结果如图1显示，佛手柑内酯在222 nm处达到较强吸收，补骨酯素在245和222 nm处达到较强吸收，选择222 nm作为试验检测波长。在此波长处对2种标准品分别进行25.556 min和16.705 min的保留，而在样品中二者的保留时间分别为25.353 min和16.566 min，确保具有良好的分离度。采用外标法对样品中2种活性成分含量进行计算，绘制标准曲线。结果显示，制备0～12 h样品中佛手柑内酯与补骨酯素的峰面积相对标准偏差分别为0.96%和0.85%，证明样品溶液在12 h内保持稳定。同时，对检测方法的重复性和精密程度验证结果为，试验检测的两种五指毛桃活性成分的峰面积RSD均比1.5%小，证明检测方法在重复性和精密程度方面经得起检验。

图1 五指毛桃中佛手柑内酯与补骨酯素高效液相色谱结果

3.2 马尾松林下种植五指毛桃不同生长年限下的植物学性状比较

马尾松林下种植五指毛桃不同生长年限下植物学性状情况如表1所示。

表1 不同生长年限下五指毛桃植物学性状(平均值±标准差)

表1结果显示，在相同的生态环境下，生长年限的增长会影响五指毛桃的植物学性状。

不同生长年限下五指毛桃在株高方面表现出明显的差异，2年生五指毛桃的株高与1年生相比增加有217.19%，3年生比2年生增长41.79%，4年生比3年生增长3.60%。能够看出，五指毛桃在移栽后的1～2年内株高增加最为迅速，属于速生阶段，其次为3年生，4年生的株高长势最为缓慢。

不同生长年限五指毛桃的基径差异显著。2年生比1年生增粗77.34%，3年生比2年生增粗36.12%，4年生比3年生增粗8.41%。能够看出，2年生和3年生基径增粗率十分显著，4年生的差异有所减少，证明增粗速度逐渐放缓。

不同生长年限五指毛桃的根长差异显著，2年生比1年生增长229.42%，3年生比2年生增长11.36%，4年生比3年生增长7.67%。能够看出，2年生五指毛桃侧根增长速度最快，之后是3年生，4年生最后。根长的生长动态与株高相似，同样能够说明移栽后1～2年是五指毛桃的速生期。

不同生长年限五指毛桃的最大根茎差异显著，2年生比1年生增粗108.96%，3年生比2年生增粗51.43%，4年生比3年生增粗24.06%。可见，在试验的几个生长年限中，2年生与3年生的基径增粗最明显，而4年生的差异相对不明显。

而侧根数在试验结果中并未表现出显著性差异，故对此不分析。

3.3 马尾松林下种植五指毛桃不同生长年限下的生物量变化动态

马尾松林下种植五指毛桃不同生长年限下的生物量变化动态如表2所示。

表2 不同生长年限下五指毛桃生物量变化动态 g/株

由表2可知，不同生长年限五指毛桃的鲜重和干重均表现出显著差异，呈现出正相关的关系。1～4年生五指毛桃平均各株鲜生物总量分别为781.33、2520.54、3567.9、3989.17，平均各株干生物总量分别为245.89、1047.38、1565.78、2020.96。同时从总生物量的增长上能够看出五指毛桃的生物量会随着生长年限的增长而有增加，2年生增长率最大，为325.74%；其次为3年生增长率为49.50%；最后为4年生29.13%，可以发现五指毛桃的生物量增长速率呈现为逐渐降低的趋势。

五指毛桃的药用主要以根茎为主，地下部分是主要的收获目标，根茎作为五指毛桃储存光合产物的主要器官，根部生物量的多少决定着五指毛桃的产量[19]。因1年生五指毛桃属于幼苗，地上部的生物量较少，在光合作用上相对较弱，对其生长速率有所限制，从而导致长势缓慢。而2年生五指毛桃进入速生期，能够大量积累光合产物，生物量迅速增加，具有最大的增长量，而在之后则会随着生长年限的增加而逐渐降低。

3.4 不同生长年限对五指毛桃活性成分含量的影响

从佛手柑内酯和补骨酯素两种活性成分来看，生长年限会对五指毛桃中的活性成分具有差异影响，这说明生长年限会直接影响五指毛桃的收获质量。测定结果如表3所示。

表3 不同生长年限下五指毛桃佛手柑内酯和 补骨酯素的含量比较 mh/g

由表3的结果不难看出，在同一生长年限下，五指毛桃中佛手柑内酯和补骨酯素相比，后者含量要高于前者。3年生五指毛桃中佛手柑内酯和补骨酯素的含量最高。依照由高到低的顺序排列，佛手柑内酯含量：1年生>3年生>4年生>2年生；补骨酯素含量：1年生>3年生>2年生>4年生。

4 结论与讨论

在五指毛桃的生长过程中，其主根会自然向下生长，当长至一定程度后，生长速度逐渐放缓，开始从根茎处向斜下或横向长出侧根，侧根数量较多且生长速度较快。而侧根数量、根长、直径等指标则直接影响五指毛桃的产量。因此，主要以五指毛桃侧根作为试验对象。试验结果证明，马尾松林下种植五指毛桃，在生长年限为两年时进入速生期，其次为3年生。可见，五指毛桃在马尾松林下种植是可行的。

从测定结果中能够看出，1年生五指毛桃的佛手柑内酯及补骨酯素的含量最高，分析其原因，可能是由于1年生五指毛桃的根系较小，且以根皮为主，根茎量相对较少。同时梳理现有研究结果发现，佛手柑内酯和补骨酯素在五指毛桃根皮中的含量要比根茎中的含量高，且补骨酯素的含量要高于佛手柑内酯。

林下种植药材作为人工林多目标经营中重要项目，必须对中药材的产量及经济效益进行充分的考虑。林下中药材的种植普遍采用粗放式的种植模式，不需要再施用化肥，属于一种仿野生的种植方式。考虑在野生环境中无法明确得知药材的具体生长年份，导致采收的药材在质量上具有一定差异[20]。而林下种植这一模式则能有效弥补上述弊端，可根据药材的最佳采收期采收相应年限的药材，不仅能够保证采收到的药材质量统一，还能保证药材的药用效果达到最高。对于五指毛桃而言，佛手柑内酯和补骨酯素是衡量其质量的关键依据，倘若采收过早，药材中积累的药用活性成分较少，无法保证药材产量和质量；如果采收过晚，则会导致药材老化，品相较差。根据研究结果显示，这两种药用活性成分在一年生的五指毛桃中含量最高，之后随着生长年限的增加开始下降，三年生又比二年生的含量要高。这一点说明五指毛桃中的药用活性成分并非随着生长年限的增长一直提高，而是在生长至一定年限后不再增加，开始降低。所以，必须对五指毛桃的最佳采收期进行合理的确定，以确保采收品质。结合不同年限五指毛桃生长性状、生物量变化以及活性成分含量，最终确定五指毛桃的最佳采收期为三年，建议选取三年生的五指毛桃入药。