陈瑞敏，刘放，谈红*，韩淑芳，陈英剑，苏丛丛

心力衰竭（HF）是各种心血管疾病导致心室收缩和/或舒张功能障碍的一组临床综合征［1］。HF患者糖尿病患病率为10%～47%，住院HF患者糖尿病患病率达40%以上；糖尿病是HF的独立危险因素，糖尿病患者中HF患病率为9%～22%，比普通人群高4倍，60岁及以上糖尿病患者HF患病率更高［2-3］。合并HF的2型糖尿病（T2DM）患者发生心肾临床结局的风险增加［4-5］。西班牙的一项回顾性研究中发现T2DM合并HF患者的住院期间死亡风险和心肾临床结局风险均显著增加［6］。目前临床上采用以“血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）/血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）/血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（ARNI）、醛固酮受体拮抗剂、β-受体阻滞剂”为主的“金三角”药物治疗HF，但HF患者的再住院率、死亡率仍然很高。2019年DAPA-HF研究结果重磅发布，国内外指南相继更新，达格列净被正式列入HF标准治疗，推动HF治疗由“金三角”转向“新四联”，为HF的治疗增加了新的选择［7］。

达格列净作为钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（SGLT2i）的代表药物，已证实其具有独立于降糖作用之外的心血管保护作用。《2021年欧洲心脏病学会急慢性心力衰竭诊断与治疗指南》［7］已明确推荐将SGLT2i（达格列净、恩格列净）用于HF的治疗。CURTAIN等［8］研究表明在射血分数减少的心力衰竭（HFrEF）患者的常规治疗基础上加用达格列净可降低患者发生严重室性心律失常、心脏骤停和猝死的风险。LIN等［9］研究表明达格列净能够抑制心肌纤维化和内质网应激，改善血流动力学。王慧等［10］进行的关于SGLT2i治疗HF疗效及安全性的Meta分析表明，SGLT2i尤其是达格列净可提高HFrEF患者的生存率，且安全性较好。上述证据均表明达格列净具有较好的心血管保护作用，但其改善HF预后的作用机制尚未完全阐明。已有研究表明，微小RNA（miRNA）可以调控相关基因表达，在心肌细胞损伤、凋亡、心肌纤维化等方面发挥着重要作用［11-12］。既往研究表明慢性心力衰竭（CHF）患者血浆miRNA-423-5p表达水平升高，并且随着心功能好转，其表达水平降低［13］。但达格列净是否通过调控miRNA-423-5p表达而发挥改善心功能的作用尚未见相关报道。故本研究纳入T2DM合并CHF患者，观察达格列净对心功能的改善作用及其与miRNA-423-5p水平的相关性，进一步探索达格列净改善HF预后的作用机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入2021-04-01至2021-11-30就诊于解放军第九六〇医院的T2DM合并CHF患者50例为研究对象。纳入标准：（1）年龄18～80岁；（2）CHF诊断符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018年》［14］标准，即HF病程≥3个月，纽约心脏病协会（NYHA）心功能分级Ⅱ～Ⅳ级，且左心室射血分数（LVEF）＜40%；（3）T2DM诊断符合《中国2型糖尿病防治指南（2020年）》［15］标准，存在典型的糖尿病症状，随机血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖（FBG）≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L或糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%，且T2DM病程≥3个月；（4）入组前未服用过SGLT2i；（5）签署知情同意书。排除标准：（1）急性失代偿HF者；（2）1型糖尿病者；（3）严重心律失常、急性心肌梗死、瓣膜病、严重肺心病、肥厚型心肌病者；（4）低血压、反复低血糖发作者；（5）严重肝、肾功能不全者；（6）严重感染性疾病、血液透析、恶性疾病患者；（7）妊娠期及哺乳期妇女。另纳入同一时期于本院健康体检的心功能正常者25例。纳入标准：（1）患者18～80岁；（2）无心血管系统疾病。本研究经解放军第九六〇医院伦理委员会批准〔（2021）科研伦理审第（113）号〕，所有患者知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂及仪器 达格列净片（阿斯利康，10 mg/片）；miRNA提取分离试剂盒、miRNA反转录试剂盒及miRNA荧光定量检测试剂盒购于北京天根生化科技有限公司，聚合酶链式反应（PCR）特异上游引物由美国GeneCopoeia公司合成。微量分光光度计（NanoDrop 2000型）购自美国Therom Scientific公司，Light Cycle 480Ⅱ PCR扩增仪购自瑞士Roche公司。

1.2.2 分组 将符合纳入标准的T2DM合并CHF患者分为达格列净组（n=25）和对照组（n=25），达格列净组给予达格列净10 mg/d，对照组给予其他降糖药物，余治疗原则相同，治疗6个月。健康体检心功能正常者为健康人群组（n=25）。

1.2.3 资料收集 通过数字病历系统收集患者的基本资料，包括年龄、性别、吸烟史（定义为连续或累计吸烟时长≥6个月，吸烟量≥1支/d）、高血压史（定义为临床诊断明确、服用或未服用降压药物）、血压水平、体质指数（BMI）、血脂〔总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）〕、血糖（FBG、HbA1c）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、肌酐（Cr）、氨基末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、NYHA心功能分级、心脏彩超〔LVEF、左心室舒张末期内径（LVEDD）、每搏输出量（SV）、左心室短轴缩短率（LVFS）〕、合并用药情况。合并用药包括利尿剂（呋塞米片、螺内酯片）、β-受体阻滞剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）抑制剂（ACEI，ARB）、硝酸酯类药物、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、抗血小板药物、曲美他嗪；并留取血液标本进行miRNA-423-5p的检测。资料收集由两位心内科医师独立完成，并进行交叉核对，确保信息的准确性及真实性。

1.2.4 随访 以纳入患者入组后首次服用达格列净的时间为随访起点，随访观察6个月。治疗4周时进行门诊随访，收集患者心功能指标及miRNA-423-5p的结果。治疗6个月时进行门诊随访，收集患者心功能指标、血压水平、ALT、AST、Cr。

1.2.5 血浆样本的收集、分离及储存 分别于患者入院后第2天清晨和健康体检者体检时采集空腹肘静脉血4 ml，置于抗凝管中，于4 ℃条件下3 000 rpm离心10 min（离心半径15 cm），收集上清液。将上清液等量分装后保存于-80 ℃冰箱中备用。T2DM合并CHF患者于治疗4周后再次采集肘静脉血4 ml，如前方法处理。

1.2.6 血浆总RNA的提取 将冻存的血浆样本在室温下解冻，4 ℃条件下15 000 rpm/min离心5 min，转移200 μl上清液至新的RNase-Free EP管中。按照试剂盒说明书进行总RNA的提取，以RNase-Free水作为空白对照进行调零，1.9＜OD260/OD280＜2.1说明RNA纯度良好。选取质量好的标本进行反转录。

1.2.7 检测血浆miRNA-423-5p水平 血浆miRNA-423-5p水平检测采用反转录及荧光定量PCR法。按照试剂盒说明书进行3'末端加多聚A尾及反转录。将得到的反转录反应液作为模板，以U6作为内参，进行定量PCR反应。miRNA-423-5p的相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，采用配对t检验比较组内干预前后的指标变化；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验，采用配对秩和检验比较组内干预前后的指标变化；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析或Spearman秩相关分析探究miRNA-423-5p表达水平与患者心功能指标的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 3组研究对象年龄、性别、吸烟史、高血压、收缩压、舒张压、BMI、TC、LDL-C、HDL-C、TG、Cr比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；达格列净组与对照组患者NYHA心功能分级、利尿剂使用情况、其他药物使用情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3组间一般资料的比较Table 1 Comparison of general data between three groups

2.2 对照组与达格列净组干预4周、干预6个月心功能指标的比较 干预6个月达格列净组患者LVEF、SV、LVFS高于对照组，LVEDD低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组干预4周、干预6个月LVEDD较同组干预前降低，LVEF、SV、LVFS较同组干预前升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 对照组与达格列净组干预前后心功能指标的比较Table 2 Comparison of cardiac function indices between control group and agliazine group before and after intervention

2.3 干预4周NT-proBNP与miRNA-423-5p水平比较干预4周达格列净组NT-proBNP、miRNA-423-5p水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组干预后NT-proBNP、miRNA-423-5p水平较同组干预前降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 对照组与达格列净组干预4周NT-proBNP、miRNA-423-5p水平的比较Table 3 Comparison of NT-proBNP and miRNA-423-5p levels between control group and dapagliflozin group after four weeks of intervention

2.4 干预4周miRNA-423-5p表达水平与NT-proBNP水平、LVEF的相关性分析 相关性分析结果显示，血浆miRNA-423-5p表达水平与NT-proBNP水平呈正相关（rs=0.609，P＜0.05），与LVEF呈负相关（r=-0.406，P＜0.05）。

2.5 达格列净组干预前与干预6个月血压及肝肾功能指标的比较 达格列净组患者干预后收缩压、舒张压较干预前降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预后ALT、AST、Cr与干预前比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 达格列净组干预前与干预6个月后血压及肝肾功能指标比较Table 4 Levels of blood pressure，and liver and kidney function indices in dagagliflozin group before treatment and after six months of treatment

3 讨论

HF的发病机制十分复杂，发病早期交感神经兴奋性增强，RAAS激活发挥代偿作用以维持正常的心脏输出，但随着病情进展逐渐出现心肌细胞损伤、心肌纤维化、心室重构等不可逆转的心脏结构变化［1］。随着社会进步发展，糖尿病患者数量不断增加，临床上糖尿病与HF多合并发生，二者相互促进并彼此增加疾病的发生风险［2-3］。2019年DAPA-HF研究重磅发布，国内外指南相继更新，达格列净被正式列入HF标准治疗［7］。

DAPA-HF研究入选伴或不伴T2DM的HFrEF患者4 744例，以HF加重或心血管死亡作为主要终点事件，经过18.2个月的随访观察发现达格列净可减少26%的HF患者死亡等不良事件风险［16］。相关研究表明，达格列净具有利尿、降糖降压、促进酮体生成、增加血红蛋白水平等作用，但其改善HF预后的具体机制尚不明确［17］。刘海浪等［18］研究发现达格列净可以明显下调HF大鼠心脏miRNA-671的表达水平，改善心功能。达格列净通过影响miRNA的表达来发挥其改善心功能的作用有待进一步研究。

miRNA是一类长20～24个核苷酸的非编码RNA，在人体生长、发育的各个阶段均发挥着重要作用。miRNA不仅可在疾病的某些特定阶段特异性表达，还可通过调控基因表达，在心肌细胞损伤、凋亡、纤维化及血管生成等病理进程中发挥重要作用［11-12］。近年国外研究表明，miRNA-423-5p在HF患者中的表达水平升高，并且随着HF的发展而出现变化，与LVEF及NT-proBNP水平有一定的相关性［19-21］。既往研究表明，HF患者血浆miRNA-423-5p表达水平上调，并且其诊断CHF具有良好的特异度和灵敏度［22］。但达格列净对miRNA-423-5p表达的调控作用及其与心功能改善的关系目前尚未见报道。

本研究纳入T2DM合并CHF患者，研究达格列净对其血浆miRNA-423-5p表达的影响及与心功能之间的相关性，进一步明确达格列净改善心功能的作用机制。本研究中达格列净组与对照组患者基线一般资料匹配，排除相关临床干预因素对研究结果的影响。治疗前达格列净组与对照组患者心功能及血浆miRNA-423-5p的表达水平无明显差异，排除基线水平差异可能对结果产生的影响。T2DM合并CHF患者在常规治疗药物基础上加用达格列净治疗4周后，对照组与达格列净组NT-proBNP及血浆miRNA-423-5p的表达水平均明显下降，同时与对照组相比，达格列净组NT-proBNP及血浆miRNA-423-5p的表达水平下降更为明显，且血浆miRNA-423-5p表达水平与NT-proBNP水平呈正相关。治疗4周后，达格列净组及对照组患者左心室收缩功能改善，且血浆miRNA-423-5p表达水平与LVEF呈负相关。治疗6个月后，与对照组相比，达格列净组左心室收缩功能改善更为显著。本研究结果明确了血浆miRNA-423-5p的表达水平对HF诊断的意义，并证明达格列净可改善T2DM合并CHF患者的心功能，其作用机制可能与调控血浆miRNA-423-5p表达水平有关，为达格列净改善心功能、治疗HF的机制研究提供了新的方向。

本研究存在以下局限性：本研究观察病例数较少，有待继续扩大病例数量增强研究结果的可靠性。周咏梅等［23］的研究表明磷脂酰肌醇3-激酶通路可能在miRNA-423-5p参与的HF发生、发展进程中发挥着关键性作用，下一步可针对此信号通路行进一步机制研究。未来的研究可继续扩大研究病例数量并针对miRNA-423-5p的下游靶标和其他相关miRNA进行临床试验及基础研究，在分子水平上明确达格列净改善HF患者预后的作用机制，以期有助于HF的诊断及治疗。

综上所述，达格列净可改善T2DM并发CHF患者的心功能，降低NT-proBNP及LVEDD，提高LVEF、SV、LVFS，其作用机制可能与调控血浆miRNA-423-5p表达水平有关。

作者贡献：陈瑞敏、谈红负责文章的构思、研究的设计及可行性分析；刘放、陈英剑负责研究的实施；刘放、韩淑芳、苏丛丛负责数据收集、整理及统计学分析；陈瑞敏负责结果的分析与解释、论文撰写；谈红负责论文修订、文章的质量控制及审校，监督管理，对文章整体负责。

本文无利益冲突。