郭 艳，陈松梅，张钟文，刘环燚，刘 超

(乐山师范学院应用生物技术创新研究中心,四川乐山 614004)

川泽泻(Alismaplantago-aquaticaLinn.)属泽泻科泽泻属水生地道中药，在福建、浙江、广西和四川有广泛分布，种植规模巨大，2018年产量约20 000 t，仅四川年产量最大，约11 000 t，广西次之[1]。川泽泻的药用处理常采用炮制方法，利用率低，经济效益差，导致近年来种植户积极性不高。四川泽泻和广西、福建泽泻品质有差异，有“川泽泻”“广泽泻”和“建泽泻”之称[2-3]。刘红昌等[4]和金立阳等[5]分别对四川泽泻进行了指纹图谱研究，为川泽泻和其他产区泽泻品质鉴定提供了依据。泽泻富含泽泻醇等有机物，具有利尿、抗结石、降血脂、降血糖和保肝等药效，张慧娟等[6]通过泽泻中有机化合物成分的分析，对泽泻的生理应用进行了详细总结。除小分子有机化合物外，泽泻药用块茎中富含蛋白质，刘超等[7]从四川种植基地川泽泻块茎中分离出一种能使人红细胞凝集的N-乙酰葡萄糖胺及其衍生物专一性结合含糖凝集素蛋白，分子质量为22.45 kD，等电点pI为6.0。同时利用荧光淬灭技术[7]对川泽泻凝集素生色基团的分布进行了初步研究，并用化学修饰的方法[8]对川泽泻凝集素的凝集活性中心氨基酸组成和生物学构象进行了研究。不同来源的凝集素结构稳定和生理功能行驶要求不同的环境因素，特别是凝集素所处微环境的物理与化学因素对凝集素结构和生理功能有明显的影响，但物理和化学因素对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响鲜见报道。该研究探讨了温度、pH、金属离子等不同物理和化学因素对该生物学活性的影响，为揭示凝集素生物学构象及凝集活性与理化环境的关系提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂试验用川泽泻采自四川彭山谢家镇和乐山五通桥冠英镇。人血液采自乐山师范学院校医院。兔、鸡、鱼等动物血液采自乐山市中区海棠路农贸市场。所用化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1川泽泻凝集素样品的制备。参照文献[7]方法并稍作改动，川泽泻干燥块茎经研磨、硫酸铵沉淀、离子交换层析(DEAE-Sepharose)和甲壳素N-乙酰葡萄糖胺亲和层析得到凝集素样品，4 ℃保存备用。

1.2.2血细胞悬液的制备。分别取人血(4种血型)和动物(家兔、家鸡、鲤鱼)血样10 mL，加少许枸橼酸钠，用0.9%生理盐水1∶1(v/v)混匀离心(2 500 r/min，4 ℃，15 min),重复至少3次洗去血浆其他成分，血细胞沉淀用0.9%生理盐水稀释至2%，滴1～2滴0.2%叠氮化钠，4 ℃保存备用。

1.2.3凝集素凝集血细胞活力的测定。参照文献[9]在96孔“V”型板上倍比稀释法检查凝集血细胞活性。

1.2.4温度对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响。按10 ℃梯度在20～100 ℃，凝集素样品恒温10 min后用自来水流水或冰水冷却至室温，用A型血细胞悬液测定凝集血细胞活性[10]。

1.2.5pH对川泽泻凝集素凝集血细胞活性的影响。凝集素样品对pH为2.0、2.5、3.4、4.0、4.6、5.4、6.0、6.8、7.6、8.4、9.0的系列缓冲液充分透析2 h后用A型血细胞悬液检查凝集血细胞活性[9]。

1.2.6金属离子对凝集素凝集血细胞活性的影响。将凝集素样品溶液在0.05 mol/L的EDTA溶液中充分透析并放置过夜，以除去凝集素样品中金属离子，检测其对血细胞的凝集活性；然后均分为7份，其中一份置于0.9%生理盐水再次透析除去EDTA后，检测血细胞凝集活性；再次将其余6份分别滴加一滴0.01 mol/L的K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+，以未经EDTA处理的凝集素样品为对照，检测凝集A型血细胞活性[8]。

2 结果与分析

2.1 血细胞凝集活性川泽泻凝集素对不同种类代表动物血细胞的凝集活性见表1。表1显示，川泽泻凝集素对不同类型血细胞的凝集活性存在差异，与刘超等[7]的研究结果一致。在供试血细胞中，川泽泻凝集素仅对人类血细胞具有敏感性，能够使人类血细胞凝集，其中对A型血细胞具有一定偏爱性，使A型血细胞凝集的效价为0.95 μg/mL，O型、AB型和B型血细胞凝集效价分别为15.30、15.30和31.50 μg/mL。而对哺乳类家兔以及家鸡血细胞无凝集能力，鱼类鲤鱼血细胞在与川泽泻凝集素接触时发生溶血性细胞破裂。凝集素能够使血细胞凝集是高度专一和复杂的与糖或衍生物识别过程，川泽泻凝集素能够识别人类血细胞而不识别哺乳动物家兔、家鸡和鱼类鲤鱼血细胞，是因为川泽泻凝集素是N-乙酰葡萄糖胺专一性结合凝集素[7-8]，表明川泽泻凝集素可识别一些乙酰化的糖链。由于人类血细胞表面具有N-乙酰葡萄糖胺糖和N-乙酰半乳糖基团[11]组成的糖被。凝集素和人类ABO血细胞表面的N-乙酰葡萄糖胺相互作用，通过凝集素分子桥的作用使血细胞凝集成团。凝集素表现出对A型血细胞的偏爱性，可能是A型血细胞与其他类型血细胞表面糖链的空间构象有差异[10]。

表1 凝集素对不同动物血细胞凝集活性Table 1 Hemagglutinating activities of lectin samples to different animal erythrocytes

2.2 温度对川泽泻凝集素凝集活性的影响从图1可以看出，随着温度的上升，在20～40 ℃，川泽泻凝集素对A型血细胞保持较强凝集活性；当温度上升至40 ℃以后，血细胞凝集活性剧烈降低；当温度升至80～100 ℃时，凝集素完全失活。表明川泽泻凝集素和桑巴镰刀菌[12-13]等凝集素一样具有40～50 ℃的低耐热性，不如已知的杨树菇凝集素、黄精凝集素和石蒜凝集素[14-16]具有70 ℃的高热稳定性。当凝集素样品随温度高于80 ℃时出现大量的血细胞絮凝沉淀，此时凝集素蛋白质变性，失去凝集血细胞活性，将血细胞包裹成团。

图1 温度对凝集素活性的影响Fig.1 Effects of different temperatures on the hemagglutinating activities of APL

2.3 酸碱度对川泽泻凝集素凝集活性的影响从表2可以看出，当pH在4.0～8.4时，川泽泻凝集素均呈现对A型血细胞凝集活性，其中在pH为6.0～6.8时，凝集活性最强，这一结果表明凝集素对pH的耐受能力较强，即酸碱度对川泽泻凝集素凝集活性中心构象影响是渐变过程。当pH为低于5.4或高于7.6时，凝集活性逐渐降低；当pH≤3.4或pH≥9.0时，川泽泻凝集素不能使血细胞凝集，反而发生过酸或过碱的溶血性细胞破裂。在凝集素等电点pI与pH一致且pH为6.0时凝集活性最强，这一现象与蛋白质等电点溶解度最低原理理论上此时凝集能力应该降低[17]相矛盾，推测可能是由于凝集素溶于等电点溶液中，在测试过程中滴加了几乎等体积生理盐水配制的血细胞悬液使测试环境pH高于凝集素的等电点，也有可能是在非等电点环境中引起了蛋白质自身非特异性凝集[16]。

表2 酸碱度对川泽泻凝集素凝集活性的影响Table 2 The hemagglutinating activities of lectin samples treated with various pH

2.4 金属离子对川泽泻凝集素凝集活性的影响从表3可以看出，在用0.05 mol/L EDTA充分透析处理后，川泽泻凝集素凝集A型血细胞活性消失，表明川泽泻凝集素蛋白分子中含有维持凝集活性所必需的金属离子，推测川泽泻凝集素凝集血细胞生物学活性依赖于金属离子。经EDTA透析除去金属离子后的川泽泻凝集素样品中分别加入Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+后，凝集血细胞活性均有一定恢复，再次证明川泽泻凝集素血细胞凝集活性对Mg2+、Mn2+、Ca2+和K+有不同程度的依赖性。其中对Ca2+的依赖性最强，说明该凝集素与其他凝集素相似[18]对金属离子有一定选择依赖性。加入Zn2+后，凝集素的凝集活性没恢复，表明川泽泻凝集素血细胞凝集活性对Zn2+无依赖性。在所有测试金属离子对凝集活性过程中，发现在高浓度(1 000 μg/mL)凝集素条件下，测试血细胞均出现溶血现象，可能是由于高浓度凝集素和金属离子相互作用，从而引起血细胞微环境渗透压的变化，造成血细胞破裂。

表3 金属离子对川泽泻凝集素凝集活性的影响Table 3 Effect of metal ions on hemagglutinating activity of APL

3 讨论

凝集素是一类非免疫来源的能与糖或衍生物可逆专一性结合的蛋白质，在植物、动物、微生物体内广泛分布。由于凝集素具有细胞识别、信号传导、细胞免疫、诱导细胞凋亡、诱导分裂、抗肿瘤以及代谢调节等生理功能[19-24]，近年来引起广泛关注。由于肿瘤细胞中存在异常的糖基化，因此凝集素类糖蛋白常作为肿瘤生物标记物，可以利用凝集素的糖结合专一性特点，开发凝集素作为肿瘤诊断试剂[25]以及肿瘤药物定向靶位[26]等。现在已经从不同的生物体内分离出近千种凝集素。在应用中环境温度、酸碱度、气压、磁场、金属离子、蛋白酶以及盐酸胍、脲、SDS等变性剂对凝集素的生物学活性均有不同程度的影响，实际应用受到一些限制。在已知的植物凝集素研究发现，杨树菇凝集素[14]、黄精凝集素[15]和石蒜凝集素[16]等普遍对70 ℃具有较强的耐受性，该研究的川泽泻凝集素与长裙竹荪菌丝体凝集素[13]类似呈现弱的热稳定性，在温度达到40 ℃凝集活性开始降低，70 ℃时活性也仅40%左右。凝集素的热稳定性是由凝集素的糖结合位点的空间结构决定的，如果凝集素活性位点仅由蛋白质构成，热稳定性会较低，如果凝集素活性位点含有糖链，热稳定会增加，由此推测川泽泻凝集素的血细胞凝集活性位点无糖链或者含糖量较低[27]。pH梯度对川泽泻凝集素凝集活性研究结果表明，在pH 5.4～7.6具有凝集血细胞活性，超过这个范围凝集活性剧烈下降，在pH 6.0～6.8凝集活性最强，说明川泽泻凝集素与长裙竹荪菌丝体凝集素[13]、面包树果实凝集素[28]等凝集素一样具有较强的酸碱耐受性。有许多凝集素血细胞凝集活性依赖于金属离子，如长裙竹荪菌丝体凝集素[13]和条斑紫菜凝集素[29]凝集活性依赖于Ca2+和Mg2+，该研究的川泽泻凝集素同样表现出Ca2+的依赖性。据此可以推断川泽泻凝集素血细胞凝集活性位点和C型凝集素结构上均具有Ca2+依赖型的糖识别结构域[30]。对于川泽泻凝集素的研究还将从N-乙酰葡萄糖胺专一性识别分子机理以及理化因素引起凝血活性变化的分子机构基础进一步研究，特别是血细胞与凝集素分子间相互作用机制和基因分子水平的研究为川泽泻应用开发提供新的理论基础。

4 结论

川泽泻凝集素(APL)是一种N-乙酰葡萄糖胺专一性结合蛋白质，能够使人类细胞发生凝集作用，并且对A型血细胞还具有一定偏好性。该凝集素在50 ℃以下稳定，当温度高于60 ℃构象发生变化，凝集活性开始降低，到80 ℃完全失去凝集活性。该凝集素最适pH为6.0～6.8，并且凝集活性依赖于金属离子，呈现对Ca2+、Mg2+依赖选择性。