邱名寅，吕海洲，周和丽,劳林芳，陈 珠，田朝阳

(1.海南金港生物技术股份有限公司,海南海口 571100；2.海南大学生物医学工程学院/海南省生物医学工程重点实验室，海南海口 570228；3.海南大学全健康研究院，海南海口 570228)

由于非人灵长类动物(non-human primates，NHPs)具有与人类极其相似的遗传、生理和行为特征[1]，与其他动物如啮齿类、犬和猪相比，非人灵长类动物在解剖学、生理学和内分泌学等方面的结果更可靠，因而在联系基础研究和临床应用方面发挥重要作用，已成为转化医学研究中理想的模式动物。其中，同为旧大陆猴和猕猴属动物的食蟹猴(Macacafascicularis)和恒河猴(Macacamulatta)是生物医学研究中使用最为广泛的2种非人灵长类动物[2]，尤以食蟹猴占主导地位。近年来，我国的实验猴养殖产业有了飞速发展，已成为全球实验猴的最大生产供应国。据中国实验灵长类养殖开发协会(CLPA)2021年统计，全国实验猴养殖企业60余家，实验猴总存栏量23万余只。

由于受新冠(COVID-19)疫情全球大流行、新冠防控疫苗及药物临床前动物试验研究需求增加、中国脑计划等重大基础研究项目的启动和禁止从国外进口食蟹猴种源等多重因素的影响，我国目前存栏的食蟹猴已逐步迈入中老年阶段(年龄≥10岁为中年猴；年龄>15岁为老年猴)[3]，普遍出现了种群繁殖率和出生率偏低、供需矛盾紧张和销售价格不断攀升的“一猴难求”的共性问题[4]，给整个医药研发产业链的健康发展带来了深远影响，已引起业界和管理部门的高度重视。但这些中老年食蟹猴也为人类衰老相关的慢性疾病研究所急需的自发性食蟹猴动物疾病模型(如糖尿病及其并发症糖尿病肾病等)的筛查与分析提供了丰富的宝贵资源库，实验猴养殖企业迎来了快速发展和转型升级的绝佳机遇期。

因此，建立中老年食蟹猴常规的尿液指标背景数据，不仅对其筛查与分析应用提供重要的参考价值，也为标准化的非人灵长类实验动物生产管理和日常疾病的检测与诊断发挥日益重要的作用。笔者对100只10～20岁的食蟹猴的体重和尿肌酐、24 h尿液量、尿微量白蛋白、24 h尿微量白蛋白和尿液微量白蛋白与肌酐比值等尿液指标进行了全面系统的测定，并进行了性别间的比较，为中老年食蟹猴资源在生物医学领域的开发与推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料普通级食蟹猴100只，雄性21只，雌性79只。年龄10～20岁；动物生产单位为海南金港生物技术股份有限公司，动物生产许可证号[SCXK(琼)2020-0001]。动物均饲养于海南金港生物技术股份有限公司普通级动物实验室[SYXK(琼)2019-0017]，饲养条件为12 h/12 h昼夜周期，相对湿度40%～70%，温度20～26 ℃，不锈钢代谢单笼饲养，饲喂全价膨化饲料，动物饮水瓶自由饮水。动物实验方案经海南金港生物技术股份有限公司实验动物使用和管理委员会(IACUC)批准。

1.2 测定项目与方法

1.2.1体重(body weight，BW)。动物空腹时间>16 h，08:00—10:00称重，称重前肌注盐酸氯胺酮(0.1 mL/kg)进行麻醉，采用电子婴儿秤进行称量并逐一记录。

1.2.2尿液指标(urine index)。将100只待检动物分批放入不锈钢代谢单笼内饲养用于收集24 h尿液，尿液收集方法为在代谢单笼底部固定纱布用于尿液过滤和粪尿分离，玻璃烧杯放置在代谢笼底部用于收集尿液，并用加装有冰袋的泡沫盒对玻璃烧杯进行冷藏保温。24 h尿液收集完毕后测定24 h 尿液量(24-hour urine volume,24 h-UV)，然后取出部分尿液离心(离心力3 000 r/min，4 ℃离心10 min),取尿液上清，应用日本东芝120全自动生化仪及上海科华检测试剂盒进行尿肌酐(Urine creatinine，UC)指标检测和美国贝克曼库尔特IMMAGE特定蛋白分析仪及配套试剂进行尿微量白蛋白(Urine microalbumin，UM)指标检测，并用24 h-UV和UM相乘后换算得出24 h尿微量白蛋白(24-hour urine microalbumin，24 h-mAlb)，用UM和UC相除后换算得出尿液微量白蛋白与肌酐比值(microalbumin-creatinine ratio，ACR)。

1.3 数据处理应用SPSS 22.0软件对试验数据进行统计与分析，结果以Mean±SD表示，采用t检验统计方法，比较各测定指标雌雄间差异，显著性差异水平α=0.05。

2 结果与分析

2.1 体重指标雌、雄性动物的体重指标(BW)差异极显著(P<0.01)，雄性显著高于雌性(表1)。

2.2 尿液指标雌性动物的尿肌酐(UC)与雄性动物相比差异显著(P<0.05)，雌性动物24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白与肌酐比值(ACR)与雄性动物相比差异不显著(P>0.05)(表1)。

表1 中老年食蟹猴体重和尿液指标Table 1 The body weight and urine index of 100 middle and old-aged cynomolgus monkeys (mean±SD)

3 结论与讨论

在生物医学研究中，动物参考值在评价临床前发现和选择健康受试动物方面起着至关重要的作用[5]。包括食蟹猴在内的所有实验动物的临床生理生化指标是重要的试验基础数据，而且实验动物的正常血常规参考值、血液生化参考值是病理学、毒理学以及新药安全性评价研究等选择实验动物的重要依据之一[6-7]。尿液指标也是重要的试验基础数据，有助于发现很多已经出现或者仍隐匿的机体健康问题，具有重要的临床意义与价值。但有关中老年食蟹猴(>10岁)的尿液指标的参考值鲜见报道。

该研究测得的中老年食蟹猴(10～20岁)体重指标(BW)表现出极显著性别差异。结合李冰[8]和Choi等[5]的研究结果，随着年龄的增长食蟹猴雌雄间体重差异会越来越显著。这就提示在做试验方案设计时注意不同年龄段雌雄动物间体重指标的差异问题。

尿液指标检测分析对于非人灵长类动物的自发型疾病模型筛选至关重要，但限于动物的习性，采集非人灵长类动物随机尿(Spot urine)样本显得较为困难，通常的做法是采用代谢笼进行一段时间的尿液收集，将动物排泄的尿液和粪便分离，但收集过程易受到粪便、饮水等因素的影响而波动较大。所以考虑收集24 h尿液量并做定量分析来减少上述因素的干扰，以期最大限度地发挥尿液指标在相关研究中的参考价值。

该研究测得的中老年食蟹猴的24 h尿液量(24 h-UV)、尿微量白蛋白(UM)、24 h尿微量白蛋白量(24 h-mAlb)和尿液微量白蛋白与肌酐比值(ACR)雌雄间均无显著差异，尿肌酐(UC)指标雄性显著高于雌性。研究表明，通常在机体健康的情况下，仅有少量白蛋白可通过尿液排出体外，尿液检验通常可见少量尿微量白蛋白。一旦肾功能发生损伤，肾小球基底膜通透性增高，经尿液排出体外的白蛋白量将显著提升，致使尿微量白蛋白指标升高[9]。

微量白蛋白可作为糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)发生的早期指标，广泛应用于糖尿病肾病的早期诊断和判断病情的发展。朱华等[10]研究表明，尿微量白蛋白在糖尿病肾病的诊断与分期中沿用已久，但不同计算方法的结果正常值范围有明显差异，尤以1 L结果报告时，由于受尿量影响较大，正常范围较宽，易使部分异常标本落入正常范围而延误诊断。为此，该试验在研究过程中，通过收集24 h尿液量和测定尿微量白蛋白，进而测算出24 h尿微量白蛋白量。Gross等[11]根据尿白蛋白的排出量分为微量白蛋白尿(Microalbuminuria，MAU)和大量白蛋白尿(Macroalbuminuria，CAU)。美国糖尿病协会(ADA)推荐的MAU的诊断参考标准：300 mg>24 h-mAlb≥30 mg 或300 mg/g >ACR≥ 30 mg/g，CAU或明显肾病诊断参考标准：24 h-mAlb≥300 mg 或ACR≥300 mg/g[12]。该研究也在100只食蟹猴中发现了3只(2公和 1母)符合上述诊断标准的动物，是否为糖尿病肾病动物模型还需做进一步的病理分析。因此，该研究为非人灵长类动物自发型代谢性疾病模型的筛选分析提供了初步的尿液指标参考值。

此外，日趋严重的人口老龄化问题急需开展生物医学基础研究，以便更好地了解生物衰老以及特定年龄相关疾病和状况的生物学机制和治疗策略[1]。自然衰老的中老年食蟹猴也会发生类似于人类的与年龄相关的疾病，且表现出相似的个体间变异性[13]，在疾病特征和发生发展机制方面能较全面反映人类衰老情况[14]，因此是研究衰老机制及临床转化所必不可少的动物模型[15]。该研究为中老年食蟹猴动物疾病模型的挖掘和开发利用提供了较为基础的尿液指标背景资料。