王 伟，程铭昊，赵思棋，蒋 军，由玉岩，孙冬婷，黄天鹏，吴 锋，刘连贵，张于光，刘学锋

（1.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044；2.北京动物园管理处，北京，100044；3.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局生物多样性保护重点实验室，北京，100091；4.神农架国家公园，神农架林区，442421）

随着技术的发展，利用生理激素对野生动物监测已经成为野生动物管理的重要手段［1-3］。皮质醇（Cortisol）等类固醇激素参与动物的应激反应，当受到不良刺激时，皮质醇激素释放量会增加，因此可以利用该激素的变化监测动物对环境变化的响应［4-5］。皮质醇激素的研究涉及黑尾近红鲌（Ancherythroculter nigrocauda）、麋鹿（Elaphurus davidianus）、东北虎（Panthera tigris altaica），以及猩猩（Gorilla gorilla）、狒狒（Papio cynocephalus cynocephalus）、短尾猴（Macaca thibetana）和滇金丝猴（Rhinopithecus bieti）等灵长类动物，探讨了不同环境压力、季节、食物和社群结构等对皮质醇激素的影响［6-12］。Zhang等［13］研究表明，社会结构的变化对川金丝猴（Rhinopithecus roxellana）个体皮质醇水平没有显著影响；杨亮亮［14］研究发现川金丝猴野外补食群全年皮质醇水平与等级关系呈负相关，不同个体的皮质醇激素水平会随季节波动。

Klotho（K）基因是一种与衰老有关的基因，K基因缺失的小鼠会加速衰老，生长受到阻滞，身体机能下降［15］。分泌型Klotho 蛋白对氧化应激具有重要的调节作用，并对抑制衰老相关的炎症反应和内质膜应激等发挥作用［16］。目前，K基因的相关研究均围绕其在心血管、肾脏、神经性损伤和癌症等临床医学疾病中发挥的作用［17-19］，尚未见到利用该蛋白对野生动物健康监测的研究报道。

川金丝猴是我国特有的国家一级重点保护野生动物，主要分布在四川、陕西、湖北和甘肃等地［20］。本研究以川金丝猴野外补食群和笼养群为对象，分析其粪便皮质醇和Klotho 激素水平在不同环境和季节中的变化规律，以及激素水平与个体性别的关系，以期获得环境压力和季节变化与川金丝猴压力激素变化的关系，为科学制定川金丝猴的保护管理策略提供依据。

1 研究方法

1.1 研究对象

研究对象包括神农架国家公园的大龙潭川金丝猴野外补食群（wild group，WG）、神农架姊妹峰的笼养群（Zimeifeng captive group，ZCG）和北京动物园笼养群（Beijing Zoo captive group，BCG）。WG 外自由采食，除偶尔有人为食物补充外，无其他人为干扰；ZCG 和BCG 均为人工繁育种群，ZCG 饲养1 或2 代；BCG已饲养多代；笼养群投喂的食物种类基本一致。

1.2 样本采集

分别于2018年秋季（9月）、冬季（12月）、2019年春季（3 月）和夏季（6 月）晴天的13：00—15：00 采集川金丝猴粪便样本。采集时，尽量采集新鲜粪便，尽量标记粪便来源个体的性别、年龄组别（成年、亚成年、幼体）和采样时间等。在每个地点，每批次至少采集5 个个体，样本放入采样袋后在冰箱-20 ℃保存［21］。共采集3 个种群的川金丝猴粪便样本238份（表1）。

表1 川金丝猴野外补食群和笼养群粪便样本采集数量Tab.1 Number of fecal samples of golden snub-nosed monkeys collected from wild group and captive groups

1.3 样本预处理和测定

1.3.1 皮质醇预处理

参照Nugraha等［22］的方法，取粪样2 g，55 ℃烘干研磨，去除毛、草等杂质后，称取干粉0.1 g 置于 10 mL 的80%乙醇中，60 ℃水浴20 min，取上清液 6 mL。再加5 mL 的80%乙醇二次浸提，60 ℃水浴20 min，再取上清液4 mL 混合得到10 mL 上清液。在坩埚中55 ℃烘干后，再加入1 mL 甲醇溶解，待检测。

1.3.2 Klotho预处理

取干燥粪便10 mg 置于0.1 mL PBS 缓冲液中稀释，超声粉碎后于5 000g转速离心10 min，取上清液，待检测。

1.3.3 激素测定

样本测定使用皮质醇和Klotho ELISA 检测试剂盒（购自北京方程BIOFINE 公司）。具体方法：将标准品稀释5 个梯度，各个梯度每孔加样量均为 50 µL，分别设置空白孔、标准品孔和待测样品孔，待测样品每份重复3 次。在待测样品孔中先加样品稀释液40 µL，再加待测样品10 µL；用封板膜封板后置于37 ℃下温育30 min。将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用；揭去封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去，重复5 次，甩干。向每孔加入酶标试剂50 µL，空白孔除外；再次封板后置37 ℃温育30 min。重复上述洗涤过程。每孔先加入显色剂A 50 µL，再加入显色剂B 50 µL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 µL，终止反应。使用空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的OD 值。测定在加终止液后15 min 内进行。最终以标准物的浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，计算出标准曲线的多项式二次回归方程，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再根据相应的稀释倍数，计算出样品的实际浓度。

1.4 数据处理

使用SPSS 17.0 软件处理数据，以mean±SD 表示，组间比较采用one-way ANOVA 检验，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 皮质醇激素水平的季节变化和环境差异

表2显示，WG和ZCG 的皮质醇激素水平具有基本一致的季节变化规律，春季激素水平开始升高，秋季达到最大值，随后下降。WG在春季的皮质醇激素水平极显著（P＜0.01）低于秋季，而BCG 在夏季皮质醇水平极显著（P＜0.01）高于其他季节，ZCG 在秋季皮质醇水平最高，但与其他季节无显著差异。不同环境条件下川金丝猴的皮质醇激素水平存在明显差异：WG的皮质醇激素水平总体低于2个笼养群；春季时，BCG的皮质醇激素水平显著高于WG（P＜0.05），秋季时BCG显著低于ZCG（P＜0.05），而夏季和冬季3个种群间皮质醇激素水平无显著差异（表2）。

表2 川金丝猴粪便皮质醇的季节变化和环境差异Tab.2 Cortisol mass fraction in different seasons and from different groups ng·g-1

2.2 Klotho激素水平的季节变化和环境差异

WG的Klotho水平在春季显著低于夏季和冬季（P＜0.05），ZCG 的Klotho 水平在春季显著高于夏季（P＜0.05），而BCG变化趋势虽然与ZCG相似，但是BCG的总体水平高于ZCG种群，而且BCG的Klotho水平无显著季节差异（表3）。春季，WG的Klotho激素水平极显著低于ZCG 和BCG（P＜0.01），而ZCG 和BCG 间无显著差异，其他季节3个种群间均无显著差异（表3）。

表3 川金丝猴粪便Klotho的季节变化和环境差异Tab.3 Klotho mass fraction in different seasons and from different groups ng·g-1

2.3 皮质醇激素和Klotho激素水平相关性

对不同环境条件下川金丝猴个体的皮质醇激素和Klotho 激素相关性进行分析，发现激素间无相关性（r=-0.056）。从全年的分析来看，BCG 的皮质醇激素水平为800～1 400 ng/g，而WG 和ZCG 的皮质醇激素水平变化十分明显，但是Klotho 的水平在不同群体间的变化相似（图1）。

图1 全年不同种群的川金丝猴皮质醇和Klotho激素相关性Fig.1 Correlation analysis of cortisol and Klotho hormones in golden snub-nosed monkeys from different groups over a year

2.4 笼养群不同性别川金丝猴压力激素水平差异

选取来自ZCG 和BCG 的160个粪便样本进行压力激素相关性分析，结果表明，雌性与雄性个体之间差异不显著，无明显相关性（图2）。

图2 笼养群不同性别川金丝猴激素水平相关性Fig.2 Stress hormone level in captive group by genders

3 讨论

皮质醇和Klotho 都是哺乳动物用于应对外部变化及自身调控所必须的激素。皮质醇是动物受到刺激时，体释放的用于调控自身代谢的激素，Klotho 则是与抗衰老相关的激素，还与各种疾病的发生相关［23］，其水平高低可表征身体健康状况，研究这2 种压力激素，可以对动物的身体状况进行评估［1-4］。本研究发现，北京动物园笼养群的皮质醇激素水平变化与当地温度变化规律一致，夏季皮质醇激素水平显著高于其他时期。由于北京地区夏季持续高温，最高气温可达38 ℃，持续高温带来的慢性热刺激，可促进下丘脑促肾上腺皮质激素释放，最终导致皮质醇激素过度分泌，这与谢爱纯等［24］对香猪的研究结果一致。神农架野外补食群的皮质醇激素水平在秋季显著高于春季和冬季。神农架姊妹峰笼养群的川金丝猴皮质醇激素水平在秋季最高，但与其他季节相比无显著差异，可能是由于神农架地区秋季气温骤降明显，急性冷应激条件下，动物交感—肾上腺轴容易激活，使糖皮质激素分泌增加以调节机体适应性和体内平衡，因此秋季激素水平升高。同时秋季也是川金丝猴的繁殖期，处于繁殖期的个体因繁殖压力也会造成皮质醇激素水平升高。

对不同环境的个体分析发现，春季川金丝猴野外补食群的皮质醇激素和Klotho激素水平显著低于2个笼养群。皮质醇激素水平低可能是春季气温回升、食物增多，生活在野外的川金丝猴生存压力减小；春季Klotho激素水平较低可能是因为冬季运动量减少及身体健康程度下降，随着气温回升，川金丝猴活动量增加，自夏季之后Klotho激素的水平开始逐渐增加。

对来自不同环境的川金丝猴个体粪便样本分析还发现，笼养群的皮质醇激素水平的变化幅度比野外补食群更小。生活在动物园的川金丝猴环境相对稳定、食物资源丰富，皮质醇激素水平也比较稳定；而野外种群需要适应不断变化的环境条件，容易受到不良环境的刺激，因此激素水平变化明显。

本研究探明了川金丝猴野外种群和笼养群的压力激素随季节变化的差异，首次检测了川金丝猴粪便中的Klotho激素，并尝试分析了2种激素之间和激素与川金丝猴个体所处环境条件、性别间的相关性，对川金丝猴的保护管理和饲养繁育具有重要的参考意义。