孙瑾喆 陈骏

在21世纪，肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的肿瘤性疾病[1]，我国肺癌发病率和死亡率也在逐年攀升[2]。化疗是晚期肺癌的重要治疗手段，顺铂（cisplatin,DDP）则是临床上最活跃的抗癌药物之一，含铂双药化疗是无驱动基因突变患者的主要一线治疗[3,4]，但顺铂耐药限制了其临床应用，成为肺癌治疗亟待解决的问题之一。因此了解顺铂耐药的分子机制、寻找预测标记物、开发更有效的药物来逆转顺铂耐药是必要的。随着甲基化检测技术的发展和表观遗传学研究的深入，学者们逐渐认识到DNA甲基化在肿瘤耐药过程中发挥着重要作用。在肺癌中常伴随着DNA异常甲基化，研究者[5,6]发现共有372个基因在顺铂耐药细胞株A549/DDP中表现出高甲基化，这些基因参与了最基本的生命过程，如细胞增殖、凋亡等。因此，本文重点描述DNA甲基化与肺癌DDP耐药的相关机制，综述近年来的研究热点基因，总结既往的研究成果，为进一步研究提供思路和方向。

1 肺癌DDP耐药机制

含铂双药化疗一直是无驱动基因突变的转移性肺癌治疗的基石[4]，Schiller等[7]对DDP联合三代化疗药物（如紫杉醇、多西他赛）在转移性非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者中进行研究，结果显示反应率为15%-20%，总生存期（overall survival, OS）为7个月-8个月。越来越多的证据表明，化疗的一些抗肿瘤活性可能是通过免疫介导。特别是，化疗被认为能在肿瘤细胞上诱导更多的程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）表达，并增加肿瘤抗原的呈递[8,9]，这也是将含铂化疗与免疫治疗相结合的原理。因此，即使在免疫和靶向治疗的时代，以DDP为基础的化疗仍然是中晚期肺癌的一线治疗方案[3,10]。DDP属于细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性。它含有类似烷化剂的双功能基团，其抗肿瘤的主要机制是作用于DNA形成链间及链内交联的DDP-DNA复合物，造成DNA损伤或干扰DNA的复制、转录和翻译，还可与核蛋白及胞浆蛋白结合，抑制RNA与蛋白质合成[11]。

然而，长期使用DDP不可避免会出现耐药，约30%初次及70%多次DDP化疗的患者会出现耐药[12]。研究[13,14]表明，DDP耐药是肺癌治疗失败的关键原因之一。DDP的耐药机制复杂，主要包括：（1）影响DNA损伤修复，如DNA错配修复基因（mismatch repair, MMR）缺陷引起DNA损伤耐受；（2）影响细胞内药物的积累，如通过ATP结合盒（ATP-binding cassette transporter, ABC）转运蛋白家族成员介导的DDP排泄增加和摄取减少；（3）“逃避”细胞凋亡信号，如Bcl-2蛋白家族、肿瘤抑制蛋白p53表达改变使细胞凋亡受到抑制等；（4）刺激生存信号的转导，影响与DDP诱导细胞死亡没有明显联系的分子途径，如肿瘤干细胞的形成和肿瘤微环境的改变[15,16]。但是，目前还没有任何一种机制能准确、完全地解释DDP的耐药性。随着探索的不断深入，越来越多的研究[5,6]发现在原发性耐药肿瘤中存在着耐药基因的表达异常，大多数都是由DNA甲基化异常所导致。此外，耐药模型研究[17]也显示，细胞毒药物产生作用后肿瘤细胞的某些耐药基因会发生DNA甲基化，促进耐药的产生。因此，DNA异常甲基化可能在肺癌DDP耐药中起非常重要的作用。

2 DNA甲基化

2.1 DNA甲基化的概念 表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化[18]，DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，与DNA修复、调节细胞周期和凋亡等关键过程相关。DNA甲基化是指基因组胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸在DNA甲基化转移酶家族（DNA methyltransferases, DNMTs）的催化下将S-腺苷酸甲硫氨酸（S-adenosine methionine, SAM）上的甲基转移到DNA分子上，使基因启动子区CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5’甲基胞嘧啶的过程[19]。CpG二核苷酸在基因组中的分布不均匀，出现频率较高的一段区域被称为CpG岛（CpG island,CGI）[20]。在人类中，CGI一般存在于基因组的第1外显子区和启动子区[21]，具有调控基因表达的作用。在肿瘤中，尽管基因组整体低甲基化，某些基因仍会由于调控区域CGI的高甲基化而失活，而在非恶性组织中则是未甲基化的[22]。DNA异常高甲基化往往能够通过降低肿瘤抑制基因的转录活性继而对该基因的表达产生影响，例如表达降低或沉默，从而间接诱导肿瘤的发生和耐药。

2.2 DNA甲基化的检测 DNA甲基化是当今肿瘤研究的热点，其检测方法也逐步得到完善。精准破译DNA在基因组上的位置信息有助于阐明DNA甲基化的生物学功能[23]。最经典的是亚硫酸盐介导法[24]，除此之外，还有酶促甲基化测序法和TET辅助吡啶硼烷测序法等[25]，但上述方法较容易产生假阳性结果，存在一定误差[26,27]。近年来随着第三代测序技术的兴起出现了更有潜力的检测技术，如纳米孔测序可以直接对DNA甲基化进行定位，但仍处于发展阶段，需要进一步优化检测条件以较好地维持酶活性和稳定性[28]。在分析微量样品时可采用单分子实时测序[29]，该方法具有测序通量高、成本低、易于操作等优点，但仍需解决荧光信号干扰等问题。

3 DNA甲基化介导肺癌DDP耐药的机制

目前，在肺癌DDP耐药方面研究最为集中和深入的甲基化基因有MMR、ABC、RAS相关区域家族1A基因（Ras association domain family 1A gene,RASSF1A）和编码钙黏蛋白超家族的基因等。它们介导肺癌DDP耐药的机制不同，因此开展深入的研究对肺癌的治疗、逆转DDP耐药具有重要意义。

3.1MMR与DDP敏感细胞相比，DDP耐药细胞显示出更强大的DNA修复能力来消除DDP诱导的DNA损伤[30]。DNA错配修复系统是细胞复制的一种修复机制，能够特异性识别DNA复制过程中出现的碱基错配、缺失错配和插入。其存在为DNA复制的高保真性和遗传物质的完整性与稳定性提供了保障。研究[31]发现，MMR还参与了细胞凋亡与增殖的调控。到目前为止共发现了9个错配修复功能基因，其中hMLH1、hMSH2最为重要。研究[32]表明hMLH1启动子甲基化可导致体外和体内DDP耐药的发生，目前机制尚不明确。有研究者[33]认为当细胞hMLH1甲基化时，细胞不能有效识别DDP介导的DNA损伤，受损细胞不会停留在G2期，或者抑制p53/非p53凋亡途径，继续进行复制，从而表现为耐药。hMLH1甲基化会增加基因组的不稳定性，引起基因功能丧失，产生对DDP耐受的突变体。需要注意的是，尽管hMSH2也在减少基因突变和维护基因稳定中发挥重要作用，但是目前没有关于其甲基化与肺癌DDP耐药的相关性研究。

3.2ABCDDP在细胞内的积累减少是耐药的主要原因之一。ABC转运蛋白超家族是一类三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）依赖性药物外排泵，通过减少细胞中的药物积累使肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物产生耐药[34]。多药耐药相关蛋白（multi-drug resistance associated proteins,MRPs）、P-糖蛋白（P-glyeoproteinn, P-gp）等经典的多药耐药蛋白均属于ABC转运蛋白家族。MRPs在正常组织中主要分布在内膜系统上，表达量低。相反，MRPs在肺癌组织中主要位于细胞膜且表达升高[35]。DDP与谷胱甘肽偶联成转运复合物后被MRPs识别，通过主动转运的方式转移至细胞外，细胞内药物浓度降低进而导致耐药。因此DDP耐药与MRPs的表达有紧密的联系[36]。多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1,MDR1）编码的P-gp过度表达也是化疗耐药的主要机制之一，与人肺腺癌细胞DDP耐药相关[34]。MDR1基因启动子低甲基化造成基因表达过度，导致肿瘤细胞产生由P-gp介导的多药耐药[37]。在肺癌细胞中MDR1基因和MRP启动子附近CpG含量丰富[38]，因此针对两者进行DNA甲基化的研究对明确及逆转肺癌DDP耐药具有重要意义。逆转MDR的策略主要集中在抑制或调控P-gp的活性，有研究[39,40]显示，大黄素和橙皮素可以通过抑制P-gp的表达逆转肺腺癌细胞的DDP耐药，可能与核因子（nuclear factor, NF）-κB通路相关。

3.3RASSF1ARASSF1A编码Ras效应蛋白，是一种被广泛研究的抑癌基因，具有调控细胞周期、诱导细胞凋亡等作用。RASSF1A因异常高甲基化失活最早在肺癌中被发现，其在NSCLC中的甲基化率为63%，在小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）中更是高达80%，是人类肿瘤中甲基化频率最高的基因之一[41-43]。尽管目前没有关于RASSF1A甲基化与肺癌DDP耐药的相关研究，但有学者[42]发现RASSF1A的甲基化状态在A549和A549/DDP之间存在明显差异，使用去甲基化剂会明显降低A549/DDP的活力，以剂量依赖的方式诱导A549/DDP凋亡。其机制有可能是RASSF1A通过灭活Keap1-Nrf2通路激活自噬，或激活Ras通路调节细胞凋亡，增强对DDP的敏感性[44,45]，这提示了该基因甲基化与DDP耐药具有潜在联系。

3.4 钙黏蛋白超家族编码基因CDH13基因编码T-cadherin蛋白[46]，同时也是一种抑癌基因，具有负性调节细胞生长的作用，影响肿瘤的发生发展。Feng等[47]发现，与正常肺组织相比，NSCLC组织中CDH13启动子区呈现高度甲基化[48]。去甲基化恢复CDH13的表达后可以逆转肺癌DDP耐药，随着甲基化抑制剂浓度的升高，CDH13的非甲基化状态增强，可加强DDP对A549/DDP的凋亡作用。CDH1编码E-cadherin蛋白，研究显示DDP耐药细胞中的甲基化频率较DDP敏感细胞明显升高[49]，并且DDP对CDH1阴性的SCLC分型具有良好的疗效[50]，但其机制尚不明确。

3.5 胰岛素样生长因子结合蛋白家族（insulin-like growth factor-binding protein, IGFBPs） IGFBP-3是IGFBPs家族含量最丰富的蛋白，其基因启动子异常高甲基化与NSCLC患者的DDP获得性耐药有关，部分机制是启动子甲基化导致该基因表达丧失并激活PI3K/Akt通路[51,52]。有研究[53]分析了NSCLC标本的基因表达，发现IGFBP-3基因启动子未甲基化有延长I期患者无病生存期（disease free survival, DFS）的趋势。因此治疗前IGFBP-3的甲基化状态可能是DDP疗效的临床生物标志物和预测因子，有助于筛选从DDP治疗中受益的患者。

除了上述基因和蛋白家族外，还有一部分研究较少的基因，其甲基化也与肺癌DDP耐药相关（表1）[54-60]。传统肺癌化疗方案的制定取决于肿瘤的分型和肿瘤原发灶-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis, TNM）分期，但是同一病理类型的患者疗效有时相差甚远。随着研究的深入，证实了基因甲基化与表达水平的检测可以作为预测肺癌DDP耐药的生物学标志应用于临床，多个标志物联合应用可以更准确地筛选出DDP敏感患者，这些标志物甚至有望成为逆转DDP耐药的治疗靶点辅助治疗。

表1 与肺癌顺铂耐药相关的DNA甲基化基因Tab 1 DNA methylation genes linked to cisplatin resistance in lung neoplasms

4 去甲基化的治疗策略

DNA甲基化是一种可逆的表观遗传学修饰方式，因此研究DNA甲基化与肺癌DDP耐药的关系有望成为逆转耐药的新方向。由于肺癌中的异常甲基化基因多表现高甲基化，因此，目前针对肺癌DNA甲基化的治疗策略集中在去甲基化上。公认的去甲基化治疗策略主要包括DNMTs抑制剂、靶向下调基因表达和联合治疗。

4.1 DNMTs抑制剂 在肿瘤中常检测到DNMTs高表达，因此抑制DNMTs活性可作为肿瘤治疗的新思路[61]。目前，5-氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine, 5-Aza-dc）是体外最常用且作用最强的一种甲基化抑制剂，其机制是抑制DNMTs从而抑制基因甲基化[62]。低剂量5-Aza-dc可以部分逆转A549对DDP的耐药性，进一步发现低剂量5-Aza-dc去除了部分hMLH1高甲基化，上调了mRNA和蛋白的表达。其临床药物如地西他滨（Decitabine, DAC）已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Adminstration, FDA）批准用于血液系统恶性肿瘤的治疗。在关于肺癌的临床试验中也发现DNMTs抑制剂具有一定的疗效。一项关于DAC治疗肺癌的I期临床试验[63]显示，36%的患者中观察到靶基因诱导。此外，一些心律失常药物如普鲁卡因胺也具有去甲基化作用，虽然作用与DAC相比较差，但已通过FDA认证并可用于治疗。还有一些靶点仍处于体外细胞和动物实验阶段[64]，需要进一步验证。

4.2 靶向下调基因表达 FDA认证了几种DNA甲基化抑制剂，如DAC、Azacitidine等，但是随之而来的各种副作用也限制了它们的临床应用，靶向治疗可能最大限度降低广谱药物副作用。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术通过靶向降解信使RNA从而选择性地抑制基因表达[65]，外源性引入小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）可诱导RNAi的发生，该过程遵循碱基互补配对原则[66]。该项技术沉默DNMTs和一些DNA启动子区基因表达也能达到逆转耐药的效果。反义寡核苷酸是一类人工合成的反义表达载体的寡核苷酸片段，导入细胞或个体后通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑制该基因表达。这两者均为基因沉默技术，可以改变DNA甲基化状态，逆转肿瘤耐药。现有一项正在进行的I期/IB期研究，在NSCLC等肿瘤患者中静脉注射NBF006（一种带有siRNA的药物成分），研究的主要终点是药物的安全性、药代动力学及初步疗效（NCT03819387）。虽然这两种技术在操作上相对简单，基因沉默效果可靠[67]，但是它们的稳定性和靶向性较差，需要研究者们继续进行相关核酸化学修饰的研究。随着基因编辑技术的兴起，CRISPR（clustered regulary interspaced short palindromic repeats）的应用也越来越广泛，CRISPR/Cas9技术的发展促进了基因研究的进展，研究者通过CRISPR/dCas9-Tet1系统靶向去甲基化NNT CpG岛可显著降低其DNA甲基化水平，抑制A549/DDP细胞的DDP耐药性。基于CRISPR的DNA甲基化编辑NNT可能是治疗肺癌DDP耐药的潜在治疗方法[56]。CRISPR/dCas9的独特优势是它能够同时针对多个位点进行靶向的去甲基化，但是存在着一定的脱靶效应，提高识别效率将是该技术应用的关键[68]。

4.3 联合用药 由于肿瘤耐药是复杂、多机制的过程，因此联合治疗可能会获得更好的疗效。虽然研究显示DNMTs抑制剂对肺癌具有一定的疗效，但单独应用在肺癌治疗中仍然受限，根源在于疗效的有限性和较为严重的不良反应，如出现剂量限制性中性粒细胞减少症[63]。DNMT抑制剂联合其他药物会有更好的疗效。最常见的是DNMTs抑制剂联合标准抗肿瘤治疗，目前一项四氢尿酸-DAC联合帕博丽珠单抗治疗晚期或转移性NSCLC的临床研究正在进行中（NCT02664181）。另外，将DNMT抑制剂与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDAC）抑制剂联合使用也是一种有前景的治疗方案，两者可以发挥不同表观遗传学作用。在一项DNMTs抑制剂阿扎胞苷和HDAC抑制剂恩替诺特联合治疗复发转移性NSCLC患者的I期/II期试验[69]中，发现两者联用可以降低靶基因（RASSF1A、CDH13等）甲基化水平，增加后续化疗的疗效，延长肺癌患者的OS 。还有一项临床研究将DAC与丙戊酸联用，研究目的是确定其在NSCLC中的安全性和耐受性（NCT00084981），遗憾的是该项研究没有公布最终结果。

尽管既往的研究在逆转肺癌DDP耐药方面取得了一些进展，但其毒副作用依然突出，例如在一项试验[69]中，所有的患者均发生至少1例与治疗相关的不良事件，28%的患者出现了3级或4级不良反应，其中以疲劳和血液学毒性最常见，并且整个队列的中位生存期只有6.4个月。研究者们应针对现有的药物做进一步修饰以提高药物的安全性、稳定性和靶向性。还需要注意的是，与肺癌DDP耐药相关的DNA也有部分呈低甲基化，如前文提到的MRD1基因，因此仅针对基因的高甲基化研发药物是不足的，针对某些低甲基化基因研发促甲基化药物也是有前景的研究方向。同时非编码序列也应被给予更多关注。

5 小结与展望

在这个检测技术快速发展的时代，DNA甲基化检测因为无创、方便和快捷等优势受到广泛关注。随着研究的深入，研究者们利用DNA甲基化芯片对DNA甲基化谱进行分析，对耐药相关甲基化基因进行筛选。DNA甲基化在肺癌DDP耐药中的作用和机制愈发明确，这也为逆转肺癌DDP耐药提供了更多靶点和可能性。但是关于肺癌DDP耐药和DNA甲基化的研究才刚刚开始，还有很多问题需要解决。

首先，DNA甲基化检测的准确度和灵敏度仍然需要提高；其次，在细胞和小鼠实验中，针对大部分异常甲基化基因的研究仍然停留在表面，更深层的机制和信号通路尚未完全明确；最后，目前的临床试验结果并不令人满意，不良反应不易控制，这可能与逆转基因甲基化状态的具体机制仍不明确有关。因此，对于未来DNA甲基化与肺癌DDP耐药的研究可以从以下几个方面进行：（1）对已经筛选出来的靶基因进行下游分子信号通路的研究；（2）开展动物和临床试验，DNMTs抑制剂联合标准抗肿瘤治疗，观察其安全性和疗效；（3）开发新的、安全性更高的DNMTs抑制剂；（4）基因靶向治疗，将参与肺癌DDP耐药的基因作为靶点。肺癌DDP耐药由多因素、多分子共同介导，任何一种机制都不足以完全解释该现象的发生。未来不仅需要聚焦于DNA甲基化，同时也应关注与组蛋白乙酰化等其他表观遗传学的联合研究，从而挖掘出更深层的发生、作用机制，筛选出真正有效的靶点，找到逆转耐药的突破口。