朱 艳，李先芝，2，严 玲，毛琼丽，石 豪，刘 洋，胡 杨，杨 峰，陈彦和

（1.劲牌有限公司，湖北大冶 435100；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435100）

随着人类生活水平的提高，人们不断加强健康理念的关注与需求。健康理念产品保健酒正逐步走进人们的视野，其以白酒作为基酒，选择有预防或滋补性能药材或药食同源物质，应用不同的手段使有效成分与酒体融合[1-2]。劲酒精选多味草本原料，采用数字提取技术，使内容物溶解在酒中，该保健酒不但含有可水溶性的草木原料多糖，还含有其他保健功能因子，它们相互加强和补充，从而更大的发挥其保健功效，以达到抗疲劳、免疫调节等保健功能[1-2]。作为重要的功能成分之一的多糖成分，对其含量的检测是一项非常有意义的工作，用紫外分光光度法测定多糖含量，参考《中国药典》[3]及相关文献[4-8]中多糖检测方法,针对该品种保健酒多糖的稳定性、精密度等进行优化，以标准曲线相关系数值和回收率实验为标准，得到好的试验方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料及试剂：D-无水葡萄糖，购于中国食品药品检定研究院；保健酒，劲牌有限公司提供；重蒸苯酚，武汉科因斯生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯，所有水均为纯水机所制一级水。

仪器设备：紫外分光光度计(型号TU-1901)，北京普析通用仪器有限责任公司；离心机（型号3K15），德国西格玛仪器公司；十万分之一电子天平（型号AB135-S），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；纯水机（型号Option R7-Flex2），威立雅水处理技术（上海）有限公司；旋转混匀器（型号WH-90A），上海振荣科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅（型号XMTD-7000），北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

精密称取烘干至恒重的葡萄糖标准品于容量瓶中，加纯水溶解并稀释到刻度，摇匀即得每毫升含葡萄糖约0.1 mg的对照品溶液。

1.2.2 样品前处理

精密量取样品适量，水浴蒸干，加5 mL 水溶解转移至离心管中，精密加入20 mL 无水乙醇，混匀，冷藏过夜，8000 r/min离心10 min，弃去上清液，20 mL 80%乙醇水溶液离心洗涤2 次，残渣加水溶解定容至适宜容量瓶中,作为供试品溶液。

1.2.3 比色液制备

分别取标准溶液1.0 mL 及供试品溶液1.0 mL于比色管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，沸水浴中煮沸15 min，冷却至室温，紫外-可见分光光度计测定吸收值。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长确定

根据1.2 中实验方法，在紫外-可见分光光度计上400～500 nm 范围内扫描吸收曲线。如图1所示。

图1 扫描图

从标准溶液及供试品溶液扫描波长可见，中国劲酒和葡萄糖溶液都在486 nm处有最大吸收峰。

2.2 供试品制备考察

2.2.1 不同取样量实验比对

分别精密量取样品5 mL、10 mL、15 mL、20 mL，水浴蒸干，分别加5 mL 水溶解转移至离心管中，精密加入20 mL 无水乙醇，混匀，冷藏过夜，8000 r/min 离心10 min，弃去上清液，80%乙醇水溶液[1]离心洗涤2 次，残渣加水溶解定容至50 mL 容量瓶中,作为供试品溶液。测定相关数据见表1。

由表1 可看出，由于样品含量较低，不同取样量可能会造成样品多糖含量检测偏差，根据最佳吸光度范围，选择10 mL取样量。

表1 不同取样量相关数据

2.2.2 不同浓度醇沉实验比对

分别精密量取10 mL 样品4 组，水浴蒸干，加5 mL、3 mL、2 mL、1 mL 水溶解转移至离心管中，分别精密加入20 mL、17 mL、18 mL、19 mL 无水乙醇，混匀，冷藏过夜，8000 r/min 离心10 min，弃去上清液，用80 %、85 %、90 %、95 %乙醇水溶液离心洗涤2 次，残渣加水溶解定容至50 mL、100 mL、250 mL、250 mL 容量瓶中,作为供试品溶液。测定相关数据见表2。

从表2 可以看出，醇沉浓度越高，检测出糖含量就越高，白酒本身含有大量的单糖，醇沉浓度越高，白酒中单糖造成测定结果偏高。通过文献等资料查找，检测多糖含量醇沉浓度选择80 %乙醇水溶液最佳[4]。

表2 不同浓度醇沉相关数据

2.3 标准曲线制备及线性考察

精密吸取每毫升含葡萄糖约0.1 mg 对照品溶液0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL 置于10 mL 比色管中，补充水至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀，加入浓硫酸5.0 mL，混匀，静置5 min，沸水浴15 min，冷却至室温。用1 cm 比色皿以试剂空白溶液为参比，于486 nm 波长处测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。测定相关数据见表3，绘制图见图2。

图2 标准溶液曲线图

表3 标准曲线建立相关数据

标准曲线：Abs=0.0752C-0.00514，R2=0.9998。

2.4 精密度实验

劲酒按照以上样品制备及显色方法，连续分析6 次，得到各分析时的测得浓度，计算测得浓度精密度实验RSD 值为0.81%，表明仪器精密性良好，检测结果的随机误差较小，见表4。

表4 精密度实验数据及RSD值

2.5 重复性实验

分别取6 批次劲酒，按照以上样品制备及显色方法，得到各次分析时的测得浓度，计算测得浓度的RSD 值重复实验RSD 值为3.48 %，表明该方法重复性稳定，检测结果的随机误差较小，见表5。

表5 重复性数据及RSD值

2.6 加标回收试验

取劲酒5.0 mL，精密称取共12 份，分别加入浓度为1068 mg/L 的葡聚糖溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，每组3 个平行，按样品重复性计算出中国劲酒含量为0.5269 mg，按照以上样品制备及显色方法，计算出添加葡聚糖的回收率，相关数据见表6。

表6 5.0 mL取样量加标回收试验

3 结论

苯酚-硫酸法测定劲酒中多糖的方法稳定，精密度高，线性范围为0～0.1 mg/mL，相关系数为R2=0.9998，平均回收率为96.64 %。在本研究试验条件下，取样量与显色有一定的关联，选用保健酒最佳体积为10 mL；醇沉浓度对多糖沉淀有较大影响，通过实验比对及文献参考，选择最佳乙醇醇沉浓度为80 %[4-8]。劲酒采用多种草本原料进行提取，酒体较为复杂，本研究为保健酒产品中多糖含量的检测提供了技术参考。