陈 凌，郭 艳，刘路宏，陈宏坤，王 毅，张 雪，周韩玲，李 毅

(宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007)

甜味剂是一类能赋予食品、饮料甜味的食品添加剂，因其能极大地改善食品的口感而被广泛应用于食品行业。甜味剂按营养价值可分为营养性甜味剂和非营养性甜味剂，按甜度可分为低甜度甜昧剂和高甜度甜味剂，按来源可分为天然甜味剂和合成甜味剂[1-2]。市场上常见的甜味剂有糖精钠、阿斯巴甜、安赛蜜、甜蜜素、纽甜、甜菊糖苷、阿力甜、三氯蔗糖、爱德万甜、甘草酸、新橙皮苷二氢查耳酮等[3]。食品与健康领域学者深入研究发现，长期食用某些人工合成甜味剂可能会引发一系列的健康问题。因发现糖精钠和甜蜜素在实验室用于动物身上会引发某些疾病，美国已禁止使用糖精钠和甜蜜素作为食品添加剂[4]。针对人工合成甜味剂在作为食品添加剂使用过程中可能会存在一些潜在风险，我国于2014 年年底发布了国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，该标准对当前市面上普遍存在的甜味剂的使用范围和最大使用量进行了限制[5]。

蒸馏酒是以粮谷、薯类、水果、乳类等为主要原料，经发酵、蒸馏、勾兑而成的饮料酒[6]。醇和是蒸馏酒评判的感官指标之一[7-8]，醇和、醇厚、绵甜、甘润等口味源自于酒体中的醇、酯、酸等有机物的协调搭配，并非依靠添加甜味剂来呈现[9]。根据GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定，蒸馏酒不允许添加糖精钠、甜蜜素等甜味剂。受经济利益驱使，一些不法分子通过向酒中添加甜味剂改善口感来获得利益，这不仅会引发潜在食品安全风险，还严重损害了蒸馏酒的行业形象[10]。因此，建立一种快速、准确定量的方法来监测蒸馏酒中甜味剂非常有必要。

酒类产品中甜味剂的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[11-14]、离子色谱法[15-16]和HPLCMS/MS 法等[17-18]，HPLC 法和离子色谱法成本低，操作简单，但仅依靠保留时间定性，容易产生假阳性。随着经济社会的发展和科学技术的进步，HPLC-MS/MS 被广泛应用于食品安全领域，使用HPLC-MS/MS 检测酒类产品中的甜味剂，可同时依靠保留时间和化合物碎片离子定性，假阳性少，结果精准[19-20]。本研究建立了一种适用于蒸馏酒中14 种甜味剂的检测方法，前处理简单，灵敏度高，分析速度快，适用于蒸馏酒生产企业开展日常甜味剂监测工作，为蒸馏酒流通领域中甜味剂检测提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：白兰地样品（编号为B，38 %vol），4 种白酒样品（编号分别为S1、S2、S3、S4，其中，S1：39 %vol；S2：42 %vol；S2：48 %vol；S4：52 %vol），2种伏特加样品（编号分别为V1 和V2，其中，V1：40%vol；V2：41%vol），所有样品均为市售。

试剂与标准品：甲醇（LC-MS 级，美国Merck公司）；甲酸（LC-MS 级，美国fisher 公司）；甲酸铵（LC-MS 级，美国fisher 公司）；糖精钠（≥99%，Sigma-Aldrich 公司）；甜蜜素（98 %，Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）；安赛蜜（98 %，百灵威科技公司）；阿斯巴甜（98%，百灵威科技公司）；纽甜（98%，百灵威科技公司）；甜菊糖苷（98%，百灵威科技公司）；甜菊双糖苷（92 %，百灵威科技）；甜菊糖苷C（98 %，百灵威科技公司）；新橙皮二氢查尔酮（≥95 %，Sigma-Aldrich 公司）；甘草酸（98 %，百灵威科技）；爱德万甜（≥97 %，Sigma-Aldrich 公司）；三氯蔗糖（98%，百灵威科技公司）；阿力甜（95%，英国Fluorochem 公司）；杜克苷A（98 %，百灵威科技公司）。

仪器设备：ExionLC-5500 型三重四级杆液相色谱-质谱联用仪，美国AB Sciex 公司；Milli-Q 型超纯水仪，美国Millipore 公司；mL1602 型百分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；AE200 型万分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；YM-060S 型超声波清洗机，深圳市雨盟超声波清洗机设备厂；HWS26 型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别准确称取（精确到0.0001 g）一定量的各种甜味剂于25 mL 容量瓶中，以40 %的甲醇水溶液（40∶60，V/V）溶解并定容，配制14 种甜味剂单标储备液，于-20 ℃避光保存。分别吸取一定量的各单标储备液于50 mL容量瓶中，用40%的甲醇水溶液稀释并定容，配制成14 种甜味剂的混合标准溶液，糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、阿斯巴甜、纽甜、甜菊双糖苷、甘草酸、新橙皮二氢查尔酮、爱德万甜、甜菊糖苷C 和杜克苷A 的浓度分别为200 μ g/L、50 μ g/L、72 μ g/L、3000 μ g/L、40 μ g/L、2000 μ g/L、144 μ g/L、120 μ g/L、600 μ g/L、5000 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、8000 μg/L、1000 μg/L，将混合标准溶液置于4 ℃环境下避光保存。试验过程中根据实际需求采用逐级稀释法稀释至合适的浓度，配制成不同浓度的标准品工作溶液。

1.2.2 样品制备

直接进样法：将白酒、伏特加和白兰地样品经0.22 μ m有机系微孔滤膜过滤后待测。

蒸干复溶法：取白酒、伏特加和白兰地样品25 mL于洁净的蒸发皿中，60 ℃水浴蒸发至近干，以40%的甲醇水溶液复溶后转移至25 mL 容量瓶中，洗涤蒸发皿3 次，将洗涤液转移至容量瓶并定容，混匀，取溶液1 mL，经0.22 μ m滤膜过滤后待测。

1.2.3 检测条件

1.2.3.1 质谱条件

14种化合物质谱参数的优化：采用针泵进样方式将14 种甜味剂标准溶液直接导入质谱仪，采用电喷雾离子源（ESI），分别在正、负模式下进行母离子扫描，根据响应强度确定检测模式和各甜味剂的母离子；在production ion 模式下进行二级质谱分析，分别选择最强和次强响应的离子碎片作为各化合物的定量离子和定性离子；在MRM 模式下，优化各化合物定量离子和定性离子的去族电压（DP）及碰撞电压（CE）。

质谱检测条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子模式扫描；毛细管电压：4500 V；气帘气：32 psi；碰撞气：7 psi；离子源温度：500 ℃；加热气1：50 psi，加热气2：50 psi；检测方式：多离子反应监测（MRM）。

1.2.3.2 液相色谱条件

液相色谱条件：流动相：A：甲酸铵溶液，B：甲醇；色谱柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μ m）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：2 μ L。流动相是本试验要研究的因素，在不同的流动相下进样分析14 种化合物标准溶液，考察流动相对质谱信号强度、各化合物分离度及峰型的影响。

1.2.4 方法学论证

1.2.4.1 线性方程、检出限和定量限

以40%的甲醇水溶液对14 种甜味剂混合标准溶液进行梯度稀释，配制系列标准溶液，进HPLCMS/MS 分析，分别以各化合物的定量离子峰面积（Y）为纵坐标，浓度为横坐标（X），进行回归分析，得到线性方程和相关系数。以定量离子S/N=3 计算各化合物的检出限，定量离子S/N=10 计算各化合物的定量限。

1.2.4.2 加标回收率和精密度

将白酒样品S1 按1.4 中直接进样法和蒸干复溶法进行样品制备，进HPLC-MS/MS 分析，计算本底值。取酒样分别加入一定量的混合标准品，按1.4 中两种方法进行处理和测定，比较直接进样法和蒸干复溶法的加标回收率。

将白酒样品S1、白兰地B、伏特加V1 按1.4 中直接进样法和方法进行样品制备，进HPLC-MS/MS 分析，计算本底值。另取2 种酒样，分别加入低、中、高3 种浓度的混合标准品，按前方法进行处理和测定，进行6 次重复实验，计算加标回收率和相对标准偏差。

1.2.4.3 实际样品分析

蒸馏酒样品过0.22 μ m 有机滤膜后进HPLCMS/MS，测定样品中14种甜味剂含量。

2 结果与分析

2.1 质谱参数优化结果

采用针泵直接进样，优化14 种甜味剂质谱参数，结果见表1。

表1 14种甜味剂质谱参数优化结果

2.2 液相色谱条件的选择和优化

通过对糖精钠等14 种甜味剂理化性质的研究，确立用C18色谱柱对目标化合物进行分离。

分别以水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、5 mmol甲酸铵-甲醇、10 mmol 甲酸铵-甲醇为流动相，进样分析14 种化合物标准溶液。实验结果表明，以甲酸铵-甲醇作为流动相时，化合物信号响应强度最高；以0.1%甲酸水-甲醇为流动相时，甘草酸峰型最好，但是，其他化合物的质谱信号响应及分离度相对较差；考察了5 mmol 甲酸铵-甲醇和10 mmol甲酸铵-甲醇作为流动相的效果，结果没有明显差异，因此，最终选择5 mmol 甲酸铵-甲醇作为本试验的流动相。以5 mmol 甲酸铵-甲醇为流动相，采用0.2 mL/min 的流速，按表2 中的洗脱梯度进行洗脱时，各化合物分离效果好，质谱信号响应强，14种甜味剂的MRM色谱图见图1。

表2 液相色谱梯度洗脱程序

图1 14种甜味剂的MRM色谱图

14 种甜味剂出峰顺序依次为：1-2.91 min：安赛蜜；2-3.70 min：糖精钠；3-4.54 min：甜蜜素；4-5.41 min：三氯蔗糖；5-5.81 min：阿斯巴甜；6-6.64 min：阿力甜；7-6.79 min：新橙皮二氢查耳酮；8-7.28 min：爱德万甜；9-7.64 min：甘草酸；10-8.13 min：纽甜；11-8.45 min：甜菊糖苷；12-8.61 min：杜克苷A；13-8.61 min：甜菊糖苷C；14-8.98 min：甜菊双糖苷。

2.3 线性范围和方法的检出限、定量限

采用HPLC-MS/MS 分析系列标准溶液后绘制标准曲线，计算14 种甜味剂的检出限和定量限，结果见表3。

从表3 可看出，14 种甜味剂在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数（R）不低于0.9991，检出限低，灵敏度高。

表3 14种甜味剂线性范围、线性方程、相关系数和检出限

2.4 样品前处理方法的选择

蒸馏酒中乙醇浓度较高，还含有一定量的可挥发性微量成分，可能会干扰目标化合物的检测。为了评估样品基质对目标化合物分析的影响，本试验以白酒样品S1 为对象，分别用直接进样法和蒸干复溶法处理白酒及其加标样品，进HPLC-MS/MS分析，计算14种甜味剂的加标回收率，结果见表4。

从表4 可看出，采用蒸干复溶法对样品进行前处理后，甜蜜素、三氯蔗糖、钮甜和爱德万甜4 种化合物加标回收率较好，在88.5 %～99.9 %之间，其他10 种化合物的加标回收率较差；采用直接进样法处理样品时，14 种化合物的加标回收率均较高，在90 %～115 %之间。表明HPLC-MS/MS 具有较强的抗基质干扰能力。采用HPLC-MS/MS 测定蒸馏酒中甜味剂时，可选择直接进样法，该法简单易操作，耗时短，人为误差少，结果准确。

表4 白酒中14种甜味物质在不同前处理方法下的加标回收率

2.5 加标回收率和精密度

样品前处理方法选择直接进样法，分别测定白酒样品S1、白兰地B、伏特加V1 中14 种甜味剂的本底值及加标后的含量，计算不同加标水平下的平均回收率及相对标准偏差，结果见表5。

从表5 可看出，不同浓度的14 种甜味物质在白酒、伏特加、白兰地中的平均加标回收率在86.1 %～119.0 %之间，相对标准偏差在2.1 %～8.5 %之间，方法的加标回收率较好，精密度高，满足痕量多组分分析要求。

表5 蒸馏酒中14种甜味剂加标回收率和相对标准偏差 (%,n=6)

2.6 实际样品的测定

利用本研究建立的分析方法对市售白兰地样品、4 种白酒样品和2 种伏特加样品中的14 种甜味剂含量进行了检测，结果发现，6 个蒸馏酒样品中均未检测出甜味剂成分。

3 结论

本研究建立了一种HPLC-MS/MS 分析蒸馏酒中14 种甜味剂含量的方法，方法学试验和实际应用考察结果表明，该方法具有样品前处理简单、成本低、灵敏度高、分析速度快、检测结果准确等优点，适用于蒸馏酒生产企业针对大量样品开展日常甜味剂监测工作，为蒸馏酒流通领域中甜味剂检测提供了技术参考。