何临梓，张校立，叶春秀，陈励坤,，王永鹏,，田 雯

(1.新疆农业大学 林学与风景园林学院，乌鲁木齐 830000； 2.新疆农业科学院 园艺作物研究所，乌鲁木齐 830000)

近年来，由梨火疫病菌(又称为解淀粉欧文氏菌Erwiniaamylovora)引起的梨火疫病已在中国库尔勒等地被证实[1]。梨火疫病是一种会导致大多数蔷薇科植物患病死亡的细菌性病害[2]。植物一旦侵染梨火疫病菌之后，便会迅速地通过组织细胞蔓延到幼嫩的叶片、枝条，形成黑褐色的溃疡斑，直至枯死。枯死的叶片不落且形成向下的翻卷状态，远远望去如同像大火焚烧过一样[3]。该病最先开始于200年前的美国哈德逊河谷一带，由于全球经济一体化，使得该病害已经传播于60多个国家和地区[4]。梨属植物早在3000年前就在中国《诗经》当中就有所记载，且以悠久的历史丰富多样的种质资源著称，现已经成为了世界性的栽培果树之一[5]。为了防控梨火疫病在中国大面积的流行，不仅要严格防控病原菌的进境检疫，还要了解中国种植的梨种质对于梨火疫病的抗病性水平及机制[6]。

在生产实践当中，几乎所有的蔷薇科的经济树种均是通过嫁接生长的。而在外界环境条件适宜的情况下，嫁接的伤口会明显增加梨火疫病的危害水平[7]。在易感病的栽培品种上，如果气候条件和树体的生理条件适宜，病原菌可以在一个生长季内从一朵感病的花一直向下移动扩散到砧木，从而致使树木死亡[7]。2000年，学者Thomson研究证实嫁接部位的伤口是梨火疫病菌极易侵染的部位，是该病扩散的一个重要阶段[8]。如若接穗与砧木均是高感病的植物，则会使病害迅速蔓延导致枝条枯死，真菌根部受到侵染[9]。如果能结合梨抗性砧木的选育，可以很好地预防梨火疫病的发生和传播，使抗病性具有更加持久和广泛的有效性[10]。

目前，对于梨火疫病的研究较为深入，其中很重要的一个防治途径就是积极寻找到有关抗性突出的梨资源，并大量培育抗性品种以供市场的需求[11]。但关于梨砧木资源对梨火疫病的抗性研究及鉴定的方面的研究鲜有报道。本研究旨在通过结合离体和活体的梨火疫病菌人工接种方式，评价不同梨砧木类型对梨火疫病的抗病性强弱，分析梨砧木资源对于梨火疫病的抗病水平，以期为抗火疫病梨砧木品种选育及梨火疫病的合理防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试种质

供试种质为秋子梨、豆梨、杜梨、川梨(表1)，于巴州农科所资源圃选取生长状态良好、长势一致的4种梨砧木类型各5株，采集当年生幼嫩的叶片及枝条(保证叶片健康完整，枝条长短和茎粗基本一致)，放入冰盒中，迅速带回实验室4 ℃保存，备用。

表1 抗病鉴定用的梨种质材料Table 1 Pear germplasm materials for identification of disease resistance

1.2 供试菌株

供试菌株Erwiniaamylovora病菌由南京农业大学胡白石教授惠赠。

1.3 细菌菌株培养

参照刘华威等[12]的细菌培养方法。首先将供试菌株接种于营养琼脂(NA+5%蔗糖)中，用封口膜密封后28 ℃培养箱中培养24 h进行细菌活化，再挑取单菌落利用平板划线法接于NA培养皿上28 ℃培养，然后将单菌落接入NB培养液中，放置于立式恒温培养箱中，28 ℃，150 r·min-1培养24 h，选取OD600=1.2左右的菌液作为接种液。

1.4 接种及取样方法

1.4.1 离体叶片接菌 离体叶片接种方法参照王宏等[13]的离体叶片接菌方法，略有改进。在4种梨砧木上选取长势一致，大小均匀、完全展开的新生叶片，用无菌水进行冲洗后再用滤纸轻轻地蘸取叶片表面的水分，此过程中避免叶片受损。用微量注射器在距离叶柄基部5 mm处接种梨火疫病菌(统一制造伤口为0.2 cm)，注意接种过程中不要穿透叶柄基部。每种砧木类型接种10片，以无菌水替代菌液，其他条件一致。将接种后的叶片悬放在三角形互为叠放的3根针头上方(防止叶片被水浸湿，导致叶片褐化)于密封好的培养皿中，培养皿中喷洒少量无菌水，注意不要喷洒于叶片表面。接菌后记录初始病斑的长度，1～7 d测定病斑长度、病斑长度与嫩梢总长的比例及发病的级别数。根据统计，计算叶片的发病率和病情指数。试验重复3次。

1.4.2 离体枝条接菌 参照李洪涛等[14]的离体枝条接种方法。截取4种梨砧木1 a生枝条各5根，保证每根长度在25 cm左右，然后带回实验室。用无菌水冲洗，下切口斜切后将其插入装有30%蔗糖溶液中三角瓶中，注意三角瓶中的溶液不超过枝条总长的1/3，然后用微量注射器在第2片完全展开叶处的茎衔接处接种2 μL的菌液(制造伤口统一为0.2 cm)，每种砧木类型接种5根枝条，对照用无菌水代替菌液，重复3次。接种后放置于27 ℃、相对湿度75%及光照3级的恒温培养箱中进行培养。接菌后记录枝条长度及病斑总长，1～7 d持续观察记录病斑蔓延长度、病斑长度占枝条总长的比例，计算发病率及病情指数。

1.4.3 活体嫩梢接菌 参照“1.4.2”离体枝条接种的方法，略有改进。选取树龄相同、健康生长和长势相似的秋子梨、杜梨、豆梨、川梨植株各5株，用无菌牙签在嫩梢的第2片完全展开叶处与茎衔接处划一个约0.2 cm的伤口，用微量注射器在伤口中注射2 μL的菌液(注意接种过程中不要穿透嫩梢的茎)，以无菌水替代菌液做对照，重复3次。接种梨火疫病菌后，观察记录1～7 d病斑长度、病斑长度与嫩梢总长的比例及发病的级别数。并计算嫩梢的发病率和病情指数。

表2为梨火疫病原菌接种离体叶片和枝条的病情分级标准，均参考李洪涛等[14]的方法并略有改进：

病情指数(DI)= ∑(各级发病枝条数×病级代表值)/(接种总枝条数×最高病级代表值)×100

弱致病力：DI为1～15；中度致病力：DI为 16～35；较强致病力：DI 为 36～69；强致病力：DI≥70。

参考 Kor-ba[15]的抗病性分级指标，制定品种抗病性划分标准(表3)。

表2 梨火疫病原菌接种离体叶片、枝条的病情分级标准Table 2 Grading standard for disease of isolated branches inoculated with pathogen of pear fire blight

表3 梨火疫病抗病性分级标准Table 3 Classification standard of resistance to pear fire blight

2 结果与分析

2.1 感病特征及抗病性比较

2.1.1 4种梨离体叶片接种梨火疫病的抗性差异 接种梨火疫病菌后，叶片均呈现出不同程度的感病特征(图1)，较为典型的症状为接种点附近及其周边都呈现出黑褐色色斑。接种后2～3 d后可观察到接种点周边微微发黑，4 d后接种点上下的叶脉组织逐渐蔓延开始变黑，部分还流出具有光泽的细菌溢，初期为白色，之后变为琥珀色，粘稠状。5～7 d叶片病斑变黑坏死。不同梨砧木类型离体叶片的病斑蔓延情况，发病枝条数、测量叶片病斑长度，计算发病率、病情指数，结果见表4。

图1 离体叶片接种梨火疫病菌的动态变化Fig.1 Dynamic changes of isolated leaves inoculated with pear fire blight

表4 不同梨种质离体叶片接种梨火疫病菌的病斑蔓延情况及接种结果Table 4 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated leaves of different pear germplasm

结果表明，4种梨砧木叶片均对梨火疫病菌侵染有显著差异(P< 0.05)，平均发病率为 68.6%～88.6%，平均病情指数为27.20～ 62.86。其中秋子梨对梨火疫病菌具有一定的耐病性，属于耐病(T)；豆梨对梨火疫病菌病情指数为42.238，属于中感(MS)；杜梨病情指数最高为62.862，属于感病(S)，川梨也属于感病(S)。从离体叶片接菌结果来看，秋子梨砧木类型对梨火疫病的抗病性较好，其次是豆梨类型。而杜梨和川梨抗病性表现较差。

2.1.2 4种梨砧木的离体枝条接种梨火疫病的抗性差异 在接种梨火疫病菌后，枝条均呈现出不同的感病特征(图2)，比较典型的特征就是在接种点附近出现了明显的色斑。在接种2～3 d后，接种点出现粘稠状的白色菌脓，会随着时间大量流出，并且白色菌脓会随着时间慢慢变成琥珀色。接种4～7 d之后，病情迅速发展，导致接种点上下的植物枝条组织变黑坏死，枝条上叶片也会变黑焦枯，但不会掉落。与病株Erwiniaamylovora的空白对照(无菌水)接种后，接种点及周边黑斑几乎无蔓延，无菌脓。不同梨砧木类型离体枝条的病斑蔓延情况、发病枝条数、枝条病斑长度及发病率、病情指数结果见表5。

图2 离体枝条接种梨火疫病菌的动态变化Fig.2 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表5 不同梨种质离体枝条接种梨火疫病菌的病斑蔓延情况及接种结果Table 5 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on isolated branches of different pear germplasm

结果表明，接种病原菌前后有显著差异(P< 0.05)，平均病情指数为16.402～33.862。秋子梨对梨火疫病菌属于耐病(T)，其病情指数为 16.402；豆梨对梨火疫病菌病情指数为18.942，属于中感(MS)；杜梨和川梨的病情指数分别为 33.862和31.005，属于感病(S)。根据离体枝条数据分析得出4种梨砧木抗病性大小依次为秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.1.3 4种梨砧木的活体嫩梢接种梨火疫病的抗性差异 在接种梨火疫病菌后，嫩梢均呈现出不同的感病特征(图3)，在接种2～3 d之后，接种点周围的组织发黑且有少量的蔓延。接种3～4 d之后，发黑有溃疡斑的部位流出白色菌脓，且发病速度变快。在接种4～5 d之后，发病部位又出现大量的白色菌脓，且有些变成琥珀色，嫩梢的顶端呈现萎蔫状。在接种5～7 d之后，嫩梢上的病斑可达数十厘米，周边的叶片萎蔫发黑，但不掉落。与病株Erwiniaamylovora对照的空白(无菌水)接种后，接种点及周边黑斑几乎无蔓延，无菌脓。不同梨砧木类型活体嫩梢的病斑蔓延情况、发病枝条数、枝条病斑长度及发病率、病情指数结果见表6。

图3 活体嫩梢接种梨火疫病菌的动态变化Fig.3 Dynamic changes of isolated branches inoculated with pear fire blight

表6 不同梨种质活体嫩梢接种梨火疫病菌的病斑蔓延情况及接种结果Table 6 Disease spot spread and inoculation results of pear fire blight inoculated on young shoots of different pear germplasms

结果表明，4种梨砧木枝条均对梨火疫病菌有感病性，且有显著差异(P< 0.05)。其中秋子梨病斑蔓延速度最缓慢，而杜梨3～4 d病斑蔓延百分比上升20.08%。说明秋子梨对于梨火疫病具有一定的抗病性，而该病原菌对杜梨有着很强的致病力。按照抗性分级可将秋子梨、豆梨、杜梨和川梨分为抗病(R)、耐病(T)、感病(S)和中感(MS)类型。4种梨砧木活体嫩梢类型的抗病性大小依次为秋子梨>豆梨>川梨>杜梨。

2.2 4种梨砧木接种梨火疫病菌相关性分析

由表7～8结果来看，秋子梨、豆梨的离体叶片发病率及病情指数略高于活体接种值，估计有可能是因为室内试验的接种环境湿度大更有利于梨火疫病菌的生长繁殖所致。且可以看出：离体叶片和离体枝条接种病原菌后得到抗病性分级一致率达到87.5%，对这3种接种方式进行相关性分析，其离体叶片与离体枝条相关系数为0.440，呈极显著相关性水平(P<0.01)；离体叶片与活体嫩梢相关系数为0.674，呈极显著相关性水平(P< 0.01)；离体枝条和活体嫩梢接种病原菌后得到抗病性分级一致率达到62.5%，相关性为 0.711，呈极显著相关性水平(P< 0.01)；说明在人工接种的情况下可以采用这3种方式进行病原菌接种，离体与活体接种方法均可以鉴定梨火疫病抗性，且鉴定结果具有一定的准确性。

表7 不同梨砧木离体叶片、离体枝条接种及活体嫩梢接种抗病性结果Table 7 Disease resistance in vitro leaves,in vitro branches and in vivo young shoots of different pear rootstocks

表8 4种梨砧木离体叶片、离体枝条接种及活体嫩梢相关性分析Table 8 Correlation analysis of inoculation of leaves and branches in vitro and young shoots in vivo of four pear rootstocks

3 讨 论

大量的国内外研究表明，如若能培育出抗病品种或筛选出对梨火疫病具有较好的抗性的砧木，就能起到很好地防控病情的作用[12]。2000年，李颖章等[16]对苹果的组培苗及温室栽培苗进行火疫病菌接种来研究它们之间的感病性，结果表明易感品种体内的病原菌数量大于较抗品种。2008年，刘华威等[12]对现保存的54份梨种质资源进行抗病性研究，结果表明中国有80.4%的梨资源对梨火疫病具有较好的抗性，东方梨品种比西方梨的抗病性更强。2019年，李洪涛等[14]采用来自国外3种不同的致病菌株对离体枝条和幼果进行抗病性鉴定，结果表明3种菌株均对供试梨种质有较强的致病力，其中2种表现为抗病性，4种耐病性，其他均为感病品种。其中的杜梨属于高感类型，与本试验结果一致。国外在抗梨火疫病方面做了不少研究，美国科学家Paprstein等[17]已培育出高抗品种——‘Bohemica’，该品种在供试的14个品种中展现出良好的抗性，并且测试了OHxF 69、87、230和333等砧木类型，结果表明，OHxF-87砧木在梨树生长和产量方面表现优异。德国学者Reininger 等[18]培育出‘雪兰多梨’新品种，具有贮藏寿命长、产量稳定、抗火疫病的生理特性。根据本研究结果可知，库尔勒近年来培育的香梨品种多是嫁接在高感砧木杜梨上，导致库尔勒地区的特色林果产量急剧下降，严重影响地方经济的发展[19]。所以，在防治梨火疫病方面，还需要继续筛选出更好的抗病资源用于抗病品种的选育，以在关键时刻起到很好地控制病情的作用，确保林果产业的安全生产[20]。

4 结 论

梨火疫病扩散蔓延速度极快，如果一旦流行起来，将会对新疆乃至全国的苹果、梨等水果产业构成威胁，同时也必将会影响中国其他水果等优势农产品的进出口贸易。故本试验采用离体叶片、离体枝条和活体嫩梢结合的方式人工鉴定不同砧木类型对梨火疫病的抗病性强弱，为开展优异梨砧木资源选育及梨火疫病的合理防治奠定理论基础。2000年，胡白石[21]就进行了花器及幼果接种来进行火疫病抗性鉴定，但他发现花器和幼果抗性阈值比较低，无法将致病力相近的菌株加以区分；并且在花器对火疫病接种鉴定方面没有形成一定权威性的抗性分级标准，而果实接种病原菌无法很好地量化其发病程度，故本试验中没有采用花器及幼果接种方式。

本试验采用的是离体与活体相结合的方式鉴定其抗病性，方便快捷的同时也能够很直观的初步得出抗病性的大小，但有学者认为植物是不存在绝对的抗性，只是对外来病原菌具有不同的反应速度[22]；植物反应取决于生长的阶段和环境条件，并且它们的对病原菌的反应速度对表型的表现也有很大的影响；离体叶片、枝条的存活时间有限，可能存在病害没有完全蔓延，而离体的组织已不能正常地生长的情况；每种梨砧木活体嫩梢之间也存在个体的差异性，也受到日照、湿度、温度等多方面的影响，可能会造成病情发展的迟缓或加剧[23]。基于上述的情况，后续的试验中将会在更加封闭隔离的状态下进行鉴定试验，确保实验的准确性。采用更好离体的叶片、枝条的保存方法，让病情发展更加真实可靠。本研究通过梨火疫病菌人工接种鉴定，分析梨砧木资源对于梨火疫病的抗病水平，以期为梨火疫病的抗病选育提供参考。