徐 萌，李程飞，潘益凯，李 曦，铁娅滕，赵星成，范洁怡，王永春

(空军军医大学航空航天医学系航空航天医学训练教研室，陕西 西安 710032)

随着载人航天事业的不断发展，失重所致的航天员心血管功能失调严重威胁航天员的健康以及任务的完成[1-3]。经航天医学实践证明，心血管系统对机械应力高度敏感，在失重或模拟失重环境下，会随着重力的变化而发生形态和功能变化，主要表现为飞行后立位耐力不良[4]，这是由于微重力环境造成的体液转移，使得机体上下半身不同部位血管所受到的跨壁压和剪切力发生了变化[5]。促红细胞生成素肝细胞激酶受体及其配体肝配蛋白(Ephrin)是酪氨酸激酶家族的最大成员，统称为Eph家族蛋白[6-9]，Eph/Ephrin是体内重要的信号通路，在治疗心肌梗死、高血压以及调控血管新生和血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)生长中具有重要作用[10-12]。根据GALE等[13]的研究，一些Eph和Ephrin在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中表达，并在VSMCs增殖及迁移中发挥作用。现有研究证明，从EphrinBs到EphB4的信号传导(正向信号传导)和从EphB4到EphrinB2的信号传导(反向信号传导)都可以调节VSMCs的收缩性[14]。国内外研究均表明，VECs与VSMCs作为血管壁的主要结构细胞[15-19]，其产生和分泌的生物活性物质在调节血管张力、调节血压、抗血栓形成等方面发挥着重要作用[20]。也有研究表明，在失重/模拟失重环境下可致VECs与VSMCs的形态、功能、结构及基因表达等发生改变[21]。然而，以往的诸如此类研究仅局限于模拟失重下单独培养内皮细胞或单独培养平滑肌细胞的作用机制研究，而在模拟失重环境下两种细胞的相互调节作用研究则屈指可数。本研究以体外共培养的人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells，HAECs)与人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells，HASMCs)为研究对象，通过细胞回转器模拟失重环境，检测VSMCs中Eph相关分子、α- 平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X, Bax)与正常组有无差异表达，并进一步明确Eph/Ephrin在VSMCs增殖和凋亡中的功能及机制。本研究进一步深化了对失重/模拟失重下血管功能异常的分子机制的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

HAECs、HASMCs、原代内皮细胞基础培养基、原代平滑肌细胞基础培养基、胎牛血清、青链霉素双抗和细胞生长因子(上海赛百慷生物技术有限公司)；EphB4抑制剂NVP-BHG712(美国APExBIO公司)；胰蛋白酶消化液和PBS磷酸盐缓冲液、1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、qPCR SYBR Green Master Mix(上海翌圣生物科技有限公司)；RNAiso Plus细胞裂解液(上海生工生物工程有限公司)；预制胶试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)；RIPA裂解液、100 mmol/L PMSF和蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；EphA2抗体、EphB4抗体、EphrinB2抗体(美国Abcam公司)；α-SMA抗体(美国Proteintech公司)；BAX抗体、PCNA抗体、Bcl-2抗体(美国Abcam公司)；PVDF膜(美国Invitrogen公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗(西安壮志生物科技有限公司)；ECL发光检测试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；qRT-PCR仪(上海罗氏)；CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司)；2D细胞回转器(中国航天员科研训练中心)；超净工作台(天津泰斯特仪器有限公司)；TS-100倒置显微镜(日本Nikon公司)；TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；化学发光仪(美国Cytiva)。

1.2 方法

1.2.1 细胞共培养 用含有50 mL/L胎牛血清、10 mL/L青链霉素双抗、10 mL/L细胞生长因子的原代内皮细胞培养基和原代平滑肌细胞培养基在含有50 mL/L CO2、37 ℃培养箱中培养HAECs和HASMCs。细胞回转舱经高压121 ℃蒸汽灭菌30 min后，打开舱盖，将Transwell小室放入舱内；在Transwell小室内膜上按照3×108个/L的密度均匀接种HASMCs的细胞悬液1 mL，同时在舱底加入适量培养基以减少膜上培养液的蒸发；封紧舱盖后放入37 ℃ CO2培养箱中静置培养过夜。第2日在内膜上按照1×108个/L的细胞密度均匀接种HAECs的细胞悬液，待细胞贴壁后，在回转舱中加满培养基；排尽舱内气泡，将排尽气泡的回转舱放入细胞回转器中，培养48 h。将细胞分为平滑肌细胞-内皮细胞共培养正常重力(Control)组、平滑肌细胞-内皮细胞共培养细胞模拟失重(MG)组、平滑肌细胞-内皮细胞共培养正常重力加抑制剂(Control+inhibitor)组、平滑肌细胞-内皮细胞共培养模拟失重加抑制剂(MG+inhibitor)组，其中抑制剂NVP-BHG712的工作浓度为10 μmol/L。

1.2.2 实时荧光定量PCR 取出回转舱的小室，用RNAiso Plus裂解小室中的细胞，提取细胞总RNA，并使用1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆转录为cDNA，以GAPDH作为内参基因，采用LightCycler® 480检测系统和qPCR SYBR Green Master Mix检测EphB4、EphrinB2、α-SMA、PCNA、Bcl-2等基因的表达情况。PCR引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 Western blotting分析 待细胞回转失重48 h后，收集回转舱内Transwell小室中的细胞总蛋白，每个小室中加入100 μL的RIPA裂解液，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸取上清进行BCA蛋白定量。每个泳道按照20 μg的蛋白量进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、快速封闭液封闭后、一抗(GAPDH为1∶1 000；α-SMA为1∶1 000；PCNA为1∶1 000；Bax为1∶1 000；Bcl-2为1∶1 000)4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜后二抗孵育1 h，洗膜后ECL化学发光观察拍照。

1.2.4 免疫荧光检测 选用8周龄的SD大鼠，随机分为正常组和尾吊组，每组各6只，悬吊28 d，每日正常喂养，待28 d尾吊结束后处死大鼠，剥离颈动脉血管后经40 g/L多聚甲醛固定，固定状态良好后，进行修剪、脱水、包埋、切片脱蜡至水、抗原修复后切片滴加封闭液进行封闭，一抗室温孵育1 h或4 ℃冰箱过夜，PBST漂洗3次后二抗室温避光孵育1 h，PBST漂洗后封片、使用荧光显微镜拍照观察。

2 结果

2.1 模拟失重下对共培养的HASMCs中EphB4-EphrinB2的影响

为了探究共培养的VSMCs中的EphB4和EphrinB2是否在模拟失重下差异表达，将HASMCs和HAECs共培养的Transwell小室置于细胞回转器中培养48 h后进行qRT-PCR检测，如图1A所示，结果表明模拟失重后HASMCs中EphB4和EphrinB2基因的表达显著上调(P<0.05)；为了探究EphB4和EphrinB2在共培养中的VSMCs中的作用，将HASMCs和HAECs共培养的Transwell小室置于细胞回转器中培养48 h后进行蛋白检测，如图1B～C结果所示，与Control组相比，MG组中HASMCs的EphB4和EphrinB2蛋白水平明显升高(P<0.05)，说明失重状态下可促进共培养体系中HASMCs的EphB4-EphrinB2的表达。

A：模拟失重48 h后共培养的HASMCs中的EphB4和EphrinB2基因表达；B：模拟失重48 h后共培养的HASMCs中的EphB4和EphrinB2蛋白表达；C：EphB4和EphrinB2蛋白表达量分析结果。Control：正常重力组；MG：模拟失重组。 aP<0.05。

2.2 模拟失重下对共培养的HASMCs增殖的影响

为了探究EphrinB2/EphB4通路对共培养中的VSMCs增殖的影响，将HASMCs和HAECs共培养的Transwell小室置于2D回转器中，同时加入EphB4抑制剂NVP-BHG712进行处理，培养48 h后进行蛋白检测，如图2A～B结果所示，与MG组相比，加入抑制剂后HASMCs和HAECs共培养体系中HASMCs的PCNA表达显著降低(P<0.05)；如图2A、C结果所示，α-SMA表达显著增高(P<0.05)。以上结果表明模拟失重效应可通过EphrinB2/EphB4通路促进HASMCs和HAECs共培养体系中HASMCs的增殖，促进HASMCs从收缩表型向合成表型转换。

A：模拟失重48 h后共培养的HASMCs中的α-SMA和PCNA蛋白表达；B：PCNA蛋白表达量分析结果；C：α-SMA蛋白表达量分析结果。Control：正常重力组；Control+inhibitor：正常重力加抑制剂组；MG：模拟失重组；MG+inhibitor：模拟失重加抑制剂组。 aP<0.05。

2.3 模拟失重48 h对共培养中HASMCs凋亡的影响

为了探究失重对共培养中的HASMCs凋亡的影响，将HASMCs和HAECs共培养的Transwell小室置于细胞回转器中培养48 h后进行Western blotting检测，如图3A～C结果所示，与Control组相比，Bcl-2蛋白水平明显升高(P<0.05)，Bax蛋白水平显著降低(P<0.05)；与MG组相比，抑制剂NVP-BHG712处理后，Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)，Bax水平显著增高(P<0.05)，表明失重可通过EphrinB2/EphB4通路抑制共培养体系中HASMCs的凋亡。

A：模拟失重48 h后共培养的HASMCs中的Bcl-2和Bax蛋白表达；B：Bcl-2蛋白表达量分析结果；C：Bax蛋白表达量分析结果。Control：正常重力组；Control+inhibitor：正常重力加抑制剂组；MG：模拟失重组；MG+inhibitor：模拟失重加抑制剂组。 aP<0.05。

2.4 免疫荧光检测尾吊大鼠颈动脉中EphB4的表达

为了研究模拟失重大鼠颈动脉中EphB4的表达情况，将尾吊28 d大鼠颈动脉经40 g/L多聚甲醛固定，通过免疫荧光进行检测。如图4A所示，与正常对照组相比，大鼠尾吊组中EphB4荧光明显增多，通过图4B分析红光阳性细胞比率发现，大鼠尾吊组显著升高(P<0.05)，表明模拟失重可促进大鼠颈动脉血管中平滑肌EphB4的表达。

A：正常组与尾吊组大鼠颈动脉免疫荧光；B：红光阳性细胞比率分析。绿光：CD31；红光：EphB4；蓝光：DAPI染色。 aP<0.05。

3 讨论

长时间太空飞行会使航天员出现心血管功能失调，其主要致病机制是内皮细胞功能障碍和其他炎症因子等多重作用的结果[22-24]。VECs是一种免疫活性器官，它具有组织相容性，并且可以诱导血型抗原表达白细胞的黏附分子并产生细胞因子[25]。由于存在允许电荷和代谢物通过的连接以及血管活性介质的产生和释放，内皮细胞和平滑肌细胞在结构上毗邻，并且也存在着一定的功能调控关系[26]。既往的诸多研究仅专注于模拟失重对VECs或VSMCs的单一细胞影响，而对模拟失重状态下两者之间的交互调节作用研究则鲜有报道[27-29]。根据本课题组前期研究发现，HASMCs的形态、功能及表型在单独培养和与内皮细胞共培养时对相同刺激的反应是不一致的[30]。VSMCs位于动脉最厚的中膜，在不同刺激下通过收缩和舒张调节血管的血流和血压，在妊娠、运动和血管损伤的情况下，对于血管重塑起着至关重要的作用。在病理条件下，VSMCs失去其“收缩”表型，增殖能力增强，在失重环境下，VSMCs也会发生表型转换，由收缩型向合成型转换[31]。

Eph是受体酪氨酸激酶的最大亚家族，并被同样大的Ephrin家族的细胞表面结合配体激活。受体和配体都被分为A类和B类：9个EphA受体与5个EphA配体结合，5个EphB受体与3个EphrinB配体结合。与其他受体酪氨酸激酶一样，EphB受体信号是由受体的寡聚化和酪氨酸磷酸化启动的。其中以EphB4受体及其配体EphrinB2与血管功能研究关系最受瞩目[32]。

为阐明模拟失重状态下共培养体系中EphrinB2/EphB4通路在VSMCs增殖、凋亡等功能改变中的作用，本研究首先建立了模拟失重下HAECs与HASMCs共培养模型，并检测了HAECs与HASMCs共培养体系中模拟失重状态下EphrinB2与EphB4及VSMCs相关增殖凋亡分子的表达变化，发现与Control组细胞相比，模拟失重可促进共培养模型中HASMCs中EphrinB2与EphB4的表达，模拟失重效应可通过EphrinB2/EphB4通路促进共培养模型中HASMCs的增殖及向合成表型的转化，并抑制凋亡；最后，采用免疫荧光检测尾悬吊大鼠颈动脉中EphB4的表达情况，发现模拟失重可促进大鼠中平滑肌的EphB4的表达。

本研究初步探讨了EphrinB2/EphB4通路在共培养体系中VSMCs增殖、凋亡等功能改变中的作用，深化了对失重导致的心血管功能失调机制的认识。