刘二龙卢丽付海滨张敏金鑫鑫王兴宁

(1.黄埔海关技术中心，广东 广州 510730；2.广州海关技术中心，广东 广州 510623；3.沈阳海关技术中心，辽宁 沈阳 110016；4.沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866；5.贵阳海关综合技术中心，贵州 贵阳 550081)

引言

匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)又叫茎翦股颖、本特草，为冷地型草坪草，是禾本科翦股颖属多年生草本植物，原产于欧亚大陆，20世纪80年代曾引种部分美国俄勒岗州品种进入我国[1,2]。近年来由于各种运动场地、城市绿化的建设，使草坪草的需求量大增。为获得耐磨、生长快、易于整修和移植的草，相应出现了多种应用转基因技术的草坪草品种[3]。

ASR368匍匐翦股颖是孟山都公司和斯格兹公司共同研发的一种耐受草铵膦除草剂的转基因匍匐翦股颖品系。ASR368采用农杆菌介导PV-ASGT08质粒转入匍匐翦股颖后培育而成，其T-DNA中含有2个拷贝的cp4-epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp.strain CP4，来自农杆菌CP4的5莽草酸-3磷酸合成酶基因)，使其具有草甘膦除草剂耐受性，ASR368于2003年在美国批准上市[4]，目前尚未获得我国农业部批准。

随着各种转基因草品种的应用，其在生态环境上的安全性成为公众关注的问题之一，口岸相关监管部门也亟需相应的检测方法识别相应的未批准转基因品系。目前国内未见有ASR368品系特异性实时荧光PCR鉴别方法的报道，为完善我国转基因产品品系识别检测技术体系，本研究基于转基因匍匐翦股颖ASR368品系转入的基因盒邻接区序列，建立ASR368品系特异性实时荧光PCR检测方法，适用于其种子及植株的鉴别检测，可为相关部门监管转基因匍匐翦股颖ASR368品系提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

非转基因剪股颖、转基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麦、高羊芽、天堂草、结缕草、早熟禾、转基因大豆DAS44406、转基因玉米MIR162、转基因油菜MON88302、转基因甜菜H7-1、小麦、非转基因水稻和转基因马铃薯EH92-527-1，为本实验室购置或保存；匍匐剪股颖内源基因1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase(ACO)gene，ACO基因)(GenBank:KU921687.1)和转基因ASR368品系特异性片段质粒，为本实验室构建。

1.1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒，北京天根公司；Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；引物和探针，闪晶生物公司(终浓度稀释为10μm的引物和探针工作液)。

1.1.3 主要仪器与设备

控制型研磨机，德国IKA；微量分光光度计nanodrop2000c，美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪ABI7500FAST，美国应用生物系统公司；微滴式数字PCR，系统QX 200，美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 样品基因组DNA的提取与纯化

称取研磨好的样品80mg，使用基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取，测定提取基因组DNA的浓度，DNA溶液放置于5℃备用。

1.2.2 实时荧光PCR检测方法的建立

1.2.2.1 引物和探针设计

根据相关基因数据库所述转基因ASR368品系转入的基因盒3’端与匍匐剪股颖基因组邻接区序列，采用Primer Express设计引物和探针。通过与BLAST数据库相比对，确定引物和探针的理论特异性；引物和探针的信息，如表1所示。

1.2.2.2 实时荧光PCR反应体系建立

采用不同体积的引物探针进行优化。最后采取的扩增反应体系：25μL，包括Premix Ex TaqTM12.5μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、10μmol·L-1检测引物ASR368-F和ASR368-R各0.5μL、10μmol·L-1ASR368-P 1μL、模板2μL和ddH2O 8.3μL。

反应程序：95℃ 30s后，于95℃ 5s、60℃ 34s进行40个循环，于60℃收集荧光信号。

1.2.3 特异性测试

提取非转基因剪股颖、转基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麦、高羊芽、天堂草、结缕草、早熟禾、转基因大豆DAS44406、转基因玉米MIR162、转基因油菜MON88302、转基因甜菜H7-1、小麦、非转基因水稻和转基因马铃薯EH92-527-1的基因组DNA为模板，阳性对照为ASR368-ACO质粒，阴性对照为非转基因水稻DNA，对该检测方法的特异性进行鉴定。

1.2.4 灵敏度测试和建立标准曲线

将提取的ASR368-ACO质粒DNA稀释后用微滴数字PCR进行定量，然后用TE缓冲液分别稀释至4000000拷贝·μL-1、200000拷贝·μL-1、10000拷贝·μL-1、500拷贝·μL-1、100拷贝·μL-1、20拷贝·μL-1和10拷贝·μL-1，进行线性范围测试、可重复性测试和灵敏度检测。3个平行/浓度。

1.2.5 可重复性测试

对1.2.4中倍比稀释的DNA溶液，测定本实验建立方法的可重复性，并统计分析其标准偏差(standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

2 结果与分析

2.1 实时荧光PCR检测方法的建立

引物和探针设计：通过分析转基因匍匐剪股颖ASR368品系邻接区序列，见图1，然后根据引物与探针的扩增效果，最终筛选ASR368-F、ASR368-R和ASR368-P建立本检测方法，序列见表1。

注：阴影部分依次为ASR368-F、ASR368-P、ASR368-R。

表1 实时荧光PCR的引物、探针

2.2 特异性测试

采用1.1中农作物基因组DNA进行ASR368品系特异性方法的测试，如图2所示。由图2可知，采用ASR368特异性引物ASR368-F/R和探针ASR368-P进行测试时，只有阳性样品ASR368-ACO呈现典型荧光扩增曲线的特征，表明本文的检测方法具备良好特异性。

注：1为ASR368-ACO阳性样品；2～17分别为非转基因剪股颖、转基因苜蓿J101×J163、高梁、燕麦、高羊芽、天堂草、结缕草、早熟禾、转基因大豆DAS44406、转基因玉米MIR162、转基因油菜MON88302、转基因甜菜H7-1、小麦、非转基因水稻和转基因马铃薯EH92-527-1和空白对照。

2.3 灵敏度测试

将提取的ASR368-ACO质粒DNA溶液分别稀释至4000000拷贝·μL-1、200000拷贝·μL-1、10000拷贝·μL-1、500拷贝·μL-1、100拷贝·μL-1、20拷贝·μL-1和10拷贝·μL-1进行检测，结果如图3所示。7个浓度梯度均能有典型扩增曲线，其最低检测浓度为10拷贝·μL-1。扩增图从左至右分别为4000000～10拷贝·μL-1扩增曲线。

图3 转基因棉花ASR368品系实时荧光PCR方法灵敏度测试

2.4 制备标准曲线

利用2.3中7个浓度梯度DNA作为模板，进行ASR368品系实时荧光PCR检测，建立ASR368品系特异性序列标准曲线，以实现对ASR368品系的相对定量分析。测试结果的Ct值如表2所示，根据表2中Ct值数据与在20～800000拷贝(25μL体系中上样量为2μL)范围内7个浓度的对数值与所得Ct值建立标准曲线，如图4所示，线性回归方程为：y=-3.6096x+40.385，R2=0.987，表明本实验的ASR368品系特异性实时荧光PCR检测方法在模板量该拷贝范围内线性相关性良好，扩增效率较高；RSD介于0.78%～2.90%，表明该方法重复性良好。在线性范围内最低模板量20拷贝时，其SD和RSD均小于25%，说明本方法定量检测下限达20拷贝。

表2 实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试

图4 ASR368品系特异性序列扩增曲线及标准曲线

3 讨论

目前国内外有多个研究者通过转基因技术改良匍匐翦股颖性状[3]。王渭霞等[5]将外源基因导入匍匐翦股颖品种中获得具耐旱性状的新品系。胡繁荣[6]将经过改良的抗虫基因crylAb导入匍匐翦股颖种子胚愈伤组织，得到抗虫的转基因植株。Fu等[7]将大麦haval基因导入匍匐翦股颖，研发了耐干旱环境的植株。由于匍匐翦股颖是多年生植物草本植物，可通过形成浓密根系，或通过花粉和种子的有性繁殖进行传播。其种子生存力强，能够借助风力等从进行传播。转基因匍匐翦股颖转入相应的性状基因如耐除草剂、抗旱等，可能导致其难以在种植地区被根除；此外，转基因匍匐翦股颖草可能存在通过杂交把相应基因传递给其他草类的生态风险。

为有效应对转基因产品生态等相关风险，建立准确的检测方法对相关品系进行有效鉴别是非常必要的。目前转基因鉴别方法基本上以聚合酶链反应(PCR)的方法为主[8]，如转基因大米(Bt)[9]、转基因玉米[10]、转基因大豆[11,12]、转基因甜菜[13]、转基因棉花等[14]。为满足进出境农产品监管的需求，针对转基因匍匐剪股颖ASR368品系转入的基因盒3’端邻接区建立ASR368品系特异性实时荧光PCR检测方法，具有良好的特异性、高灵敏度和稳定性的优点，可应用于口岸监管中转基因匍匐剪股颖ASR368种子及植株的鉴别。