翟晓瑞，巩永博，吕 伟，李雨果，魏豪杰，程蓉英，刘松财，张 英，郝林琳，张一宁

(1.吉林大学 第一医院，吉林 长春 130000；2.吉林大学 动物科学学院，吉林 长春 130062；3.吉林公主岭市鑫源牧业，吉林 公主岭 136100)

梅花鹿属哺乳纲、偶蹄目、鹿科、鹿属的草食性动物，是世界上现存41种可再生茸的鹿科动物之一[1],被列入《世界自然保护联盟》低危物种和中国国家一级保护动物。梅花鹿是中国乃至世界鹿科的宝贵资源，我国吉林省占全国梅花鹿饲养量的50%[2-3]。据文献记载，我国是世界上最早将鹿茸作为药用的国家，至今已有2 000多年的历史。《中华人民共和国药典》记载：鹿茸有“强筋骨、益精血、精血亏虚、肾阳不足、阳痿滑精、羸瘦、宫冷不孕、畏寒、耳鸣、眩晕、腰脊冷痛、阴疽不敛、崩漏带下”等药效[4-5]。国内外学者已从鹿茸中提取出100多种化学成分，是鹿茸具有多种药效的物质基础[6]。鹿茸中独特的化学成分以及再生机制也将会随着科学发展为人类做出新的贡献[7-9]。国内外鹿茸市场的需求量与日俱增，以鹿茸为原料的药品和保健食品也越来越多。目前，有研究表明鹿茸尖部含有丰富的氨基酸和多肽[10]，并且被证明能够调控细胞增殖[11-12]，但是对于鹿茸根部骨化组织的功能却鲜有报道。

鹿茸根部因骨化严重而不在出口之列，只能以鹿茸平均价格的1/4销售，且深加工领域尚属空白。因此对其根部骨化组织的研究和产品开发将成为提高鹿茸应用价值的有效途径。已有研究表明，鹿茸的不同部位无机元素含量明显不同，鹿茸根部骨化部位钙离子明显高于尖部、中部，且钙磷比接近2∶1[13]，是一种良好的潜在钙来源[14]。因此，鹿茸根部骨化组织钙提取工艺的建立，对增强鹿茸根部骨化组织市场竞争力具有重要意义。

钙是人体内含量最丰富的矿物质元素，约占人体质量的2%，不仅是构成骨骼组织的主要矿物质成分，而且在机体各种生理与生化反应过程中起着重要作用。缺钙现已成为影响人类生命质量的一大公共卫生问题，根据2010—2013年全国居民营养调查数据显示，我国城乡居民一直处于不良的钙营养状态[15]，因此选择适合的钙补充剂是改善我国钙营养状况的有效措施之一。目前市场上的钙补充剂存在吸收率差、溶解度低、生物利用度低等缺陷。已有研究表明从生物的骨骼等组织中提取的有机钙具有吸收率高、生物利用度高、毒副作用小、稳定性佳等优点，是一种理想的有机补钙剂[12]。本研究通过优化鹿茸根部骨化组织可溶性钙提取工艺以获得一种良好的新型钙源，并建立人肠上皮细胞(Caco-2)模型以评价骨钙的吸收效果，为鹿茸根部骨化组织的高值化利用提供新的发展方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂鹿茸根部骨化组织购自吉林省长生鹿业有限公司；无水苹果酸、无水柠檬酸购自河南万邦实业有限公司；Caco-2细胞由吉林大学动物医学学院柳巨雄教授馈赠；Transwell插入式培养皿购自广州洁特生物有限公司；胰蛋白酶购自HyClone公司；DMEM/F-12购自Sigma公司；无钙HBSS购自上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清购自Sigma公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司。

1.2 鹿茸骨粉的制备清洗鹿茸根部骨化组织并去除其外表皮，切片，去离子水清洗骨片上的血污等杂物，使用滤纸吸去骨片表面水分后室温干燥，使用高速万能粉碎机将其粉碎，经100目筛得到鹿茸骨粉，置于-20℃备用。

1.3 单因素优化鹿茸根部骨化组织钙提取工艺1)酸种类对钙含量的影响：在温度为60℃、提取时间为40 min、酸用量为20%的条件下，分别用苹果酸、柠檬酸以及混合酸(苹果酸与柠檬酸1∶1混合)提取可溶性钙，考察酸种类对钙含量的影响。2)酸用量对钙含量的影响：设定温度为60℃，分别在酸用量为10%，20%，30%，40%和50%的条件下提取40 min，考察酸用量对钙含量的影响。3)提取时间对钙含量的影响：在温度60℃，酸用量为20%的条件下，分别提取20，40，60，80和100 min，考察提取时间对钙含量的影响。4)提取温度对钙含量的影响：设定酸用量为20%，分别在40，50，60，70和80℃的条件下提取40 min，考察提取温度对钙含量的影响。

1.4 正交试验优化钙提取工艺在单因素试验的基础上，根据正交试验设计原理，选取酸用量、提取温度和提取时间作为考察变量，采用三因素三水平进行正交分析，对鹿茸根部骨化组织钙提取工艺进行优化。

1.5 鹿茸根部骨化组织钙含量测定配制容量为10.00 mL，质量浓度依次为2.5，5.0，10.0，20.0，40.0和80.0 mg/L Ca2+标准溶液，制作标准曲线，采用火焰原子吸收光谱仪测定钙含量。

1.6 骨钙对Caco-2细胞的毒性试验根据ZOU等[16]的方法，将Caco-2细胞以1×105/孔细胞的密度接种于96孔板中，将其放置于37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育24 h，待细胞贴壁后，除去培养基，将100 μL不同浓度的样品添加到培养基中。在37℃、5% CO2培养箱中培育24 h后，向培养皿添加10 μL CCK-8试剂，在培养箱温育1 h后，用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，计算各组细胞存活率，公式如下：细胞存活率=[D测定组/D空白组]×100%。

2 结果

2.1 骨钙提取的酸种类结果如图1所示，苹果酸对骨钙的提取效果更佳，相较于柠檬酸具有显著性差异(P<0.05)，相较于混合酸具有极显著性差异(P<0.01)，骨钙含量为(5.941±0.008)mg/g，因此苹果酸为最适的酸种类。

*.差异显著(P<0.05)；**.差异极显著(P<0.01)。下同

2.2 单因素试验优化骨钙提取工艺

2.2.1苹果酸用量对骨钙含量的影响 结果如图2所示，苹果酸的用量对骨钙含量影响较大，当酸用量为10%时，骨钙含量已达到(5.115±0.143)mg/g，随着苹果酸用量的增加,骨钙含量的增加趋于平缓;当酸用量为50%时，骨钙含量为(5.691±0.051)mg/g，相较于10%酸用量仅增加了0.576 mg/g。考虑到成本及添加剂用量的限制，选择苹果酸的最适酸用量为10%。

图2 苹果酸用量对骨钙含量的影响

2.2.2提取温度对骨钙含量的影响 结果如图3所示，当提取温度小于50℃时，随着温度的增加骨钙含量增加趋势明显；当提取温度超过50℃时，随着温度的增加骨钙含量减小趋势明显，因此骨钙最适的提取温度为50℃，钙含量为(5.925±0.013)mg/g。

图3 提取温度对骨钙含量的影响

2.2.3提取时间对骨钙含量的影响 结果如图4所示，当提取时间小于60 min时，随着时间的增加骨钙含量增加趋势明显；当提取时间超过60 min时，骨钙含量随着提取时间的增加逐渐趋于平缓;当提取时间为100 min时，骨钙含量为(5.623±0.008)mg/g，相较于60 min仅增加了0.061 mg/g，考虑到加工效率，选择最适的提取时间为60 min。

图4 提取时间对骨钙含量的影响

2.3 正交试验优化骨钙提取工艺由单因素试验结果，建立正交试验设计方案(表1)其中A为酸用量，B为提取时间，C为提取温度。

表1 正交试验设计方案因素水平表

由表2和3正交试验结果分析可知，各因素对骨钙含量影响的主次顺序为：C(提取温度)>B(提取时间)>A(酸用量)。因此，提取骨钙含量的最佳组合为A1B3C3，即苹果酸用量为5%、提取温度55℃、提取时间70 min。因正交试验得出的最佳组合A1B3C3，在正交试验表里已列出，故得出在最佳组合条件下，骨钙含量为(6.136±0.015)mg/g。

表2 正交试验方案与结果

表3 正交试验分析

2.4 骨钙对Caco-2细胞的毒性试验结果如图5所示，分别将31.25,62.50,125.00,250.00,500.00 mg/L的骨钙作用于Caco-2细胞进行毒性试验，结果表明当骨钙质量浓度从31.25变化至500.00 mg/L时，细胞存活率都在90%以上，即没有表现出明显的毒性；并且当骨钙浓度从31.25变化至250.00 mg/L时，细胞存活率都在100%以上，表明骨钙对细胞有促进增殖作用。

图5 不同质量浓度的骨钙对Caco-2细胞的细胞毒性

2.5 Caco-2细胞对钙摄取率的分析结果如图6所示，分别将200 μg的骨钙和CaCl2溶液置于上室，在培养箱中培养30,60,90,120,150,180,240 min。结果表明：随着时间的增加，Caco-2细胞单层模型中骨钙组和CaCl2组的转运效率都有所提高并且骨钙组转运效率明显高于对照组，在30,60,90,120,150,180和240 min，骨钙组的钙转运量相较于CaCl2组均具有差异极显著(P<0.001)。

图6 不同时间点骨钙的转运量

3 讨论

我国人工驯养的梅花鹿现总量约110万头，我国吉林省鹿茸产量一直稳居世界前列，但是鹿茸副产品却并未得到合理的开发利用，其深加工产品较少。骨化严重的鹿茸根部只能低价销售，其附加值极低，为提高鹿茸根部骨化组织的应用价值，本研究通过优化鹿茸根部骨化组织可溶性钙提取工艺，挖掘其深度利用价值。根据单因素试验及正交试验分析得到最优提取工艺：苹果酸用量5%，提取温度55℃，提取时间70 min。在此条件下，骨钙含量为(6.136±0.015)mg/g。

在我国，将近90%的人群存在缺钙现象，通过增加食品中钙的含量还不足以解决缺钙问题，提高吸收利用率是更有效的途径。有机钙是在无机钙的基础上发展起来的第二代钙源，相比较无机钙溶解度、吸收率更高[15]，最常见的有机钙是葡萄糖酸钙和乳酸钙，其吸收也不依赖于胃酸的消化，适合吸收障碍或肠炎的患者以及长期膳食摄入钙不足的个体。人体每天能吸收饮食摄入钙的30%～80%。钙主要通过肠道吸收，Caco-2细胞来自人体结肠癌细胞株，成熟、分化好的Caco-2细胞在体外环境中与小肠上皮细胞具有相似的转运系统和标志酶的功能表达，因此常被用于体外药物吸收效果的评价。本研究通过苹果酸溶解提取的苹果酸钙，实际上也具有低毒和更佳的吸收效果，研究建立了Caco-2细胞单层吸收模型并以CaCl2为对照进行转运效果评价。试验结果表明有机补钙剂组呈现低毒性，高转运并且相较于无机钙组具有极显著性差异。

本研究建立了一种鹿茸根部骨化组织有机补钙剂的制备、检测与评价工艺，所得提取工艺简单、骨钙含量高、原料易得、毒性低、转运效果佳且具有一定实际应用价值和经济效益。该研究也为复合钙制剂、螯合钙制剂等补钙剂的发展提供理论依据，为鹿茸根部骨化组织的综合利用提供了新的方向。