姜钊，张景瑜，张卫花，孔秀梅，姜一，冀旭，赵勤

（1.西藏民族大学 西藏藏医药研究中心藏药活性成分及药理机制研究联合实验室，陕西 咸阳 712082；2.西藏民族大学 药材检测技术教育部工程研究中心，陕西 咸阳 712082；3.西藏民族大学 高原生物医学大数据挖掘与生物信息学分析实验室，陕西 咸阳 712082；4.沧州市中心医院病理科，河北 沧州061000）

《本草纲目》中记载，秦艽出秦中，以根作罗纹交纠者佳，故名秦艽[1]，中药中常用秦艽为龙胆科龙胆属植物秦艽（Gentiana macrophyllaPall.）、麻花秦 艽（GentianastramineaMaxim.）、粗 茎 秦 艽（GentianacrasicaulisDuthie ex Burk）或 小 秦 艽（GentianadahuricaFisch.）的干燥根。其具有抗炎镇痛、保护肝脏、心脑血管疾病防治、免疫抑制、消化促进、抗流感、抗肿瘤等作用，在风湿病、骨关节病、脑出血后遗症、肛肠疾病、面神经炎、皮肤病、妇科疾病、应变性亚败血症等疾病治疗方面都有显著疗效[2-3]。近代药理研究证实，秦艽主要药用成分为龙胆碱A、B、C，龙胆次碱，秦艽丙素及龙胆苦苷[4]，因此药用价值极高。1985年及2000年版《中华人名共和国药典》中规定，只有秦艽、麻花秦艽、粗茎秦艽和小秦艽可以入药[5]，而在秦艽的中药市场中其相近相似混伪品较多，如乌头属牛扁（Aconitumochranthum）、两色乌头（Aconitumalboviolaceum）、鼠尾草属甘西鼠尾草（Salviaprzewalskii）、金莲花属 短 瓣 金 莲 花（Trolliusledebouri）、黄 秦 艽（Veratrilla baillonii）、西 藏 黑 秦 艽（Gentiana wallonii）、中亚秦艽（Gentiana kaufmanniana）等[6]。使得秦艽的鉴别和药效研究极为困难，也影响了秦艽的推广和开发。

DNA条形码技术由于其快速、准确、简便等特点在中药材的分类鉴定中有着广阔的前景。常用中药材鉴定条形码有ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等基因序列[7-8]，罗焜等[6]利用ITS2对采自陕西、甘肃、云南、西藏等地的秦艽样品进行基源研究，鉴定效果显著。前期利用ITS2基因对试验样品进行鉴定，序列比对结果均为非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum），鉴定时易受真菌干扰。而psbAtrnH序列是叶绿体中位于编码光合系统II反应中心的psbA基因和编码tRNA组氨酸的trnH基因间的一段非编码序列[9]，变异位点较多，相较于编码区序列具有更丰富的系统发育信息[10]，且叶绿体基因在非编码区存在较高核苷酸置换率[11]，分辨率更高，可广泛用于中草药的分子研究。

前期研究发现，西藏地区麻花秦艽对佐剂性关节炎大鼠原发性和继发性病变足肿胀均有明显的抑制作用，同时对缺氧小鼠具有抗缺氧和抗氧化的作用[12-13]。西藏、青海、四川等地3 000 m左右高海拔地区均有野生秦艽分布，而大多数生长在高海拔地区药材处于氧含量低、日照强的环境中，其次级代谢产物具有很好的抗氧化作用[14]。

为更好地进行3个地区秦艽混伪品的区分和药效差异分析，本试验选取西藏、青海、四川地区5个样品，利用psbA-trnH序列在分析样品分类地位的基础上，检测其所含龙胆苦苷的含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率，以此评估试验药材的药效及抗氧化能力，旨在为秦艽药材的利用和开发提供科学依据，为后续药材的鉴定和药物开发奠定基础，

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验的5种样品分别为采自青海、四川和西藏3个省份5个地区的秦艽植物干燥根（表1）。所有样品均为野生药材，样品收集后自然晾干保存。

表1 材料来源及psbA-trnH序列信息Tab.1 The materials source and psbA-trnH sequences information

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 将收集的干燥根粉碎碾磨，每个样品选取2个重复，称取0.5 g，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒（DP305）提取植物基因组DNA。PCR扩增依照中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，采用psbA-trnH序列引物[15]（psbA F：5'-GTT ATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnH R：5'-CG CGCATGGTGGATTCACAATCC-3'）进行扩增。扩增体系25 μL: 5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，正、反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 14.75 μL。序列扩增程序为94 °C预变性5 min；94 °C变 性30 s，60 °C退 火30 s，72 °C延 伸35 s，33个循环；72 °C延伸10 min。

扩增后，采用凝胶电泳检测，之后使用DNA凝胶回收试剂盒（GE0101）进行DNA片段的纯化回收并送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。

1.2.2 分子进化分析 测序公司返回数据利用SeqMan软件去除引物和低质量序列，并且进行拼接。将拼接的序列通过GenBank数据库进行序列相似性分析，同时下载序列相似度较高序列为参比序列，采用Clustal X软件[16]进行多序列比对。比对结果通过MEGA 7.0[17]计算遗传距离（K2P）并利用邻近法（Neighbor-Joining）[18]，采用双参数模型（Two-parameter model）构建系统进化树，并采用Bootstrap 1 000次检验进行系统发育树的可靠性评估。

1.2.3 样本龙胆苦苷含量检测 样品使用高速粉碎机粉碎后过0.15 mm筛，称取药粉粉末约0.1 g，加入20 mL的甲醇，超声40 min后冷却，负压过滤去除药渣后检测，各3个重复。利用紫外分光光度法[19]对环烯醚萜类化合物中龙胆苦苷的标准品进行200～700 nm扫描测定，并找到测定的最大吸收峰，将标准品依次稀释为7.2、10.8、14.4、18.0、21.6、25.2、28.8 mg/L，摇匀，在最大吸收峰处测定吸光度，以标准品浓度及各标准品浓度所对应的吸光度值绘制标准曲线。同时选取样品经甲醇稀释后进行精密度、稳定性、重复性、回收率的检测[19]。检测后的数值代入标准曲线方程计算龙胆苦苷浓度。

1.2.4 样本抗氧化能力分析（DPPH清除率测定） 参考陈瀚等[20]、吴宏伟等[21]研究方法，用95%乙醇配制DPPH贮备液，浓度2.0×10-4mol/L，避光保存，现配现用。样品经高速粉碎机粉碎后过0.15 mm筛，精密称取0.1 g样品并加入95%乙醇10 mL，超声处理30 min，补齐挥发的乙醇体积。吸取1 mL稀释100倍后作为待测液。将每种样品溶液和DPPH等体积分别加入96孔板中，反应体系0.2 mL为样品组（As）。以等体积95%乙醇为对照组（Ac），蒸馏水为空白组（Ao）。加样后轻揉振荡96孔板，充分溶解后避光放置30 min，在波长517 nm处检测OD值。计算供试品溶液的DPPH自由基清除率，每组5个重复。

1.3 数据处理

运用软件Excel 2010及R 4.1.2进行数据统计和作图；同时利用SPSS 17.0中LSD最小显著差异法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 psbA-trnH序列长度、GC含量及序列差异

测序后的原始序列拼接后，经过GenBank数据库检索和多序列比对后得到了psbA-trnH序列全长，5个样品基因长度为315～392 bp，GC含量在20.32%～23.21%，每个样品的2个重复序列及比对结果一致，完整序列上传到GenBank数据库，基因序列号及相关信息如表1所示，样品序列与GenBank下载的对照序列经多序列比对后，利用MEGA 7.0进行K2P距离计算，结果如表2所示。

由表2可知，样品XZ-001、XZ-003、SC-001与参比序列粗茎秦艽（KY595461.1）的psbA-trnH序列两两之间的遗传距离均为0.000，说明西藏林芝、拉萨和四川收集的以上3个样品序列与粗茎秦艽psbA-trnH序列无差异，应属于粗茎秦艽；样品XZ-002测序序列与麻花秦艽（KJ657732.1）的psbAtrnH序列之间的遗传距离为0.000，与粗壮秦艽（Gentiana robustaKT159969.1）遗传距离为0.003，说明XZ-002更接近于以上2个物种，应属于麻花秦艽；样品QH-001与黄管秦艽（Gentiana officinalisMH261261.1）遗传距离为0.000，说明采自青海样品应为黄管秦艽。

表2 样品序列与参考序列的K2P距离Tab.2 The K2P distance of sample sequences and reference sequences

2.2 系统进化分析

基于psbA-trnH序列构建试验样品与相近物种系统进化树（NJ）如图1所示。

图1 基于psbA-trnH序列构建试验样品与相近物种系统进化树（NJ）Fig.1 The phylogenetic tree（NJ） constructed by test samples and neighboring species based on psbA-trnH sequences

将试验序列及GenBank得到的参考序列共14条序列经过统一比对，利用MEGA 7.0构建系统进化树（NJ），结果显示（图1），5个样品分别聚为3支，其中，采自西藏林芝（XZ-001）、拉萨（XZ-003）、四川（SC-001）3个样品与粗茎秦艽聚为一支，自展值为95%；XZ-001与粗茎秦艽，SC-001与XZ-003相似性分别为100%，SC-001、XZ-003与XZ-001、粗茎秦艽相似性为99.48%。由此表明，XZ-001应为粗茎秦艽，SC-001、XZ-003为同一物种，虽与粗茎秦艽相似性为99.48%，个别基因位点有差异，但还没有到种及以上级别的区分度，因此该2个样品应属于粗茎秦艽。西藏昌都样品XZ-002与麻花秦艽、粗壮秦艽聚为一支，自展值为73%，并且XZ-002与麻花秦艽基因相似性为100%，因此，确定样品XZ-002为麻花秦艽。青海样品QH-001与黄管秦艽聚为一支，自展值为70%，基因相似性为100%，故此，青海样品QH-001为黄管秦艽，5个样品的系统进化分析结果与序列的K2P距离分析结果一致。

2.3 样品龙胆苦苷含量测定

龙胆苦苷标准品全波长扫描确定在波长270 nm有最大吸收峰，按照试验浓度检测吸光度并绘制标准曲线（回归方程Y=27.550 0X+0.083 1，r=0.998），结果显示，龙胆苦苷标准品在浓度为7.2～28.8 mg/L范围内与吸光度值保持良好的线性关系。样品反复测量6次，结果显示，测量方法精密度良好（RSD=0.01%），稳定性良好（RSD=1.26%），重复性可靠（RSD=1.63%），每份样品甲醇稀释到不同浓度后，向其中精密加入已知浓度的适量龙胆苦苷标准品溶液，混匀后检测其吸光度，代入标准曲线方程，计算出样本回收率为99.12%（RSD=0.85%），表明该方法回收率良好。

样品龙胆苦苷浓度检测结果如图2所示，5个样品龙胆苦苷浓度在8.56%～12.76%，其中青海的黄管秦艽（QH-001）含量最高（12.76%），西藏昌都（XZ-002）麻花秦艽含量其次（10.47%），采自西藏林芝、拉萨及四川的3个粗茎秦艽样品（XZ-001、XZ-003、SC-001）含量较低，都在9%左右，且3个样品龙胆苦苷含量无显著性差异。研究表明，龙胆苦苷具有减少急性肺损伤引起的肺内炎症细胞及渗出物增多的作用，还可抑制炎症因子改善小鼠结肠炎损伤，并且还具有抑制肝癌细胞、抗癫痫等作用[22-23]。药典规定，秦艽药材干燥品龙胆苦苷（C16H20O9）总量不少于2.5%[24]，而本次试验样品龙胆苦苷含量均超过9%，远超药典规定，开发价值巨大。

图2 试验样品龙胆苦苷含量及DPPH自由基清除率Fig.2 Gentiopicroside content and DPPH scavenging rate of test samples

2.4 样品DPPH清除率结果测定

测定5个样品的DPPH清除率，结果表明（图2），3个已知品种中麻花秦艽＞黄管秦艽＞粗茎秦艽，即XZ-002＞QH-001＞XZ001；值得注意的是，2个粗茎秦艽相似种XZ-003的DPPH清除率优于麻花秦艽，SC-001的清除率则介于麻花秦艽和黄管秦艽之间，且所有样本之间差异极显著（P＜0.01）。整体而言，5个样品DPPH清除率为66.49%～90.68%，其中西藏林芝的粗茎秦艽近源种DPPH清除率达到90.68%。本试验5个样品DPPH自由基清除率均在60%以上，抗氧化能力强，可能与高海拔及野生环境的生长条件相关，需进一步深入研究。

3 结论与讨论

ITS基因及叶绿体多基因片段被用于西藏、甘肃等不同地区各类秦艽及其近缘种鉴定，发现ITS序列无法鉴别粗壮秦艽及麻花秦艽[25-26]。本研究采用psbA-trnH序列对测试样品进行分子鉴定，根据基因相似性、遗传距离及系统进化树位置分析，确定试验5个样品分属于3个秦艽品种，分别为粗茎秦艽（XZ-001、XZ-003、SC-001）、麻花秦艽（XZ-002）和黄管秦艽（QH-001）。同时采用ITS2基因的分子鉴定发现，所测得的ITS2基因比对结果均为非洲哈茨木霉，相似性为100%，表明测序的干燥根中含有大量非洲哈茨木霉。根据罗焜等[6]对秦艽基源研究优化的试验方法，试验前期我们用75%乙醇进行表面清洗，但依然无法解决，可能本次试验样品中有大量内生真菌。说明ITS2基因序列不适于本试验样品分子鉴定研究。本次试验样品根部拥有大量非洲哈茨木霉，可能与秦艽属植物生长或者有效药用成分积累相关。有研究表明，木霉产生的挥发性化合物中有近400种均有生物活性，具有良好的生防效果[27]；同时，木霉可产生10余种具有广谱抑菌性的哌珀霉素类物质[28-29]，这些物质在诱导植物抗性和抑菌方面具有重要作用。陈敬师等[30]研究表明，非洲哈茨木霉具有高产抑菌挥发性有机物的能力，是一株具有应用潜力的生防菌。因此，本次研究试验样品根部非洲哈茨木霉的分布与植物生长及药用成分积累的相关性需进一步研究。

试验样品的龙胆苦苷含量测定显示，采自青海的黄管秦艽含量最高，麻花秦艽其次，其余3个粗茎秦艽含量较低。根据显著性分析结果，黄管秦艽、麻花秦艽及粗茎秦艽不同种属间龙胆苦苷含量差异显著，检测的3个不同地区的粗茎秦艽样品龙胆苦苷含量差异不显著。而DPPH自由基清除率测定显示，拉萨野生粗茎秦艽高达90%以上，其余药材自由基清除率相近在70%左右，且5个样品两两间差异极显著。刘艳红等[31]研究发现，秦艽中多酚具有清除自由基能力，并且含量丰富。在对藏药植物抗氧化物质筛选中，亦发现乌奴龙胆苷E、大花龙胆苷A和乌奴龙胆苷A都有较强的抗氧化能力[32]。丁春发等[33]研究表明，野生麻花秦艽中龙胆苦苷具有较好的抗氧化能力，但其抗氧化能力的强弱与龙胆苦苷含量不成正比。这些充分说明，秦艽类植物应含有其他抗氧化作用的活性成分。虽然龙胆苦苷含量较高，但抗氧化能力可能有其他成分参与，其有待进一步研究探索。最后，本次采集样品均来自3 000 m海拔左右，海拔差异600 m左右，差异不大，在后期研究中可以扩大海拔梯度采样，同时收集相关环境因子数据，了解药用成分和抗氧化能力差异与海拔梯度及相关环境因子的相关性。为后续该类药材的种植和药效研究提供思路并奠定基础。

综上所述，psbA-trnH序列可很好区分粗茎秦艽、麻花秦艽和黄管秦艽，不同秦艽种属间龙胆苦苷含量及抗氧化能力差异显著，而药用市场秦艽来源比较复杂，利用DNA条形码技术结合药效评价对准确鉴别秦艽药材、保障临床用药安全提供了保障。