邓玲玲 陈颖 宫艺其 付炜 王伟 郑吉建 张军 郑洁 杨礼

人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CMs)已逐渐应用于构建心肌疾病模型,筛选药物等领域并显示出易获取、无伦理问题等优势。目前研究显示hiPSC-CMs仍表现为不成熟心肌细胞,在结构功能代谢方面与正常人体心肌细胞仍有一定差距[1-2]。其中自律性,动作电位形态等电生理指标是评价心肌细胞是否成熟的一项重要指标[2]。而hiPSC-CMs的自律性和动作电位形态除了与细胞培养时间和环境相关外,还受到细胞记录电生理指标前的处理方式的影响。既往hiPSC-CMs进行膜片钳电生理分析前较多采用胰蛋白酶消化后控制培养环境使细胞处于低密度状态的方法[3-4],但其合适的浓度不易制备及保存,并且需要控制培养条件。有研究发现使用Accutase酶对神经干细胞有较好分离效果[5],而且消化后存活率高于胰蛋白酶[6],在笔者前期的研究中也使用过稀释的Accutase酶进行膜片钳细胞处理[7],证实了该酶的可行性。本研究采用相对温和的Accutase酶原液,在实施膜片钳记录前对hiPSC-CMs进行消化处理。通过设置不同的消化时间,分析不同消化时间对hiPSC-CMs电生理记录的影响,探寻hiPSC-CMs建立膜片钳全细胞记录模式前的Accutase酶的最佳消化时间,以便后期更合理的评价药物等对hiPSC-CMs的成熟度以及电生理的影响。

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及溶液 Accutase酶(加拿大Stemcell公司7920),肌钙蛋白(c TNT)抗体(Proteintech公司,美国)),α-辅肌动蛋白(α-Actinin)抗体(Sigma-Aldrich 公司,美国),心肌细胞消化液(北京赛贝生物技术公司),PBS 缓冲液体(Hyclone公司,美国)。动作电位电极内液(mmol/L):NaCl 5、KCl 150、CaCl22、EGTA 5、Mg ATP 5、HEPES 10(使用KOH 调节p H 值至7.2);动作电位细胞外液(mmol/L):NaCl 140、KCl 5、MgCl21、CaCl21、HEPES 10、Glucose 10(使用NaOH 调节p H 值至7.4);动作电位的电极内外液配方试剂(生工生物工程上海股份有限公司)[8]。

1.2 心肌细胞分化方法 用Accutase酶(7920,STEMCELL Technologies,Canada)将人诱导多能干细胞(上海儿童医学中心王伟教授课题组提供)消化成单个细胞后,在铺有基质胶的12孔板上以1×106个/孔进行接种,具体的培养方法同之前发表文献[9]。

1.3 hiPSC-CMs分子生物学鉴定 hiPSCs 分化28～32天后,室温(25℃)下依次使用心肌细胞消化液Ⅰ、Ⅱ消化10、20 min,在均匀铺有基质胶的24 孔板玻璃爬片上以1×105个/孔进行接种,镜下观察细胞完全贴附于基质胶后,依次使用4%多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton X-100 破膜30 min,5%牛血清白蛋白封闭2 h,添加心肌细胞 标 志 物c TNT 抗 体 和α-Actin 抗 体(1:200),之后4℃下孵育8 h,PBS清洗3 遍后,添加相应荧光二抗(1:1 000)室温下再避光孵育2 h,最后用DAPI(1:1 000)核染10 min[9-10],荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.4 单个心肌细胞提取 将35 mm 孔径培养皿中状态良好的培养28～32天的hiPSC-CMs通过简单随机抽样法抽取5组分别用含Accutase酶消化液1 ml(37℃)消化0.5 min(A组)、1 min(B组)、2 min(C组)、5 min(D组)、10 min(E组),消化后使用动作电位细胞外液恒速灌流,另一端使用负压泵吸引。控制负压泵吸力,使培养皿内的液面保持在稳定水平。单个培养皿细胞室温(25℃)下记录时间不超过6 h[9]。

1.5 电生理记录 选择单个完整贴壁的心肌细胞进行实验,每组至少记录5个细胞。使用P-97微电极拉制仪(SUTTER 公司,美国)拉制电极,微电极内注入配置的动作电位电极内液避免微电极尖端出现气泡,可在微电极入液之前通过1ml注射器施加一定正压,入液后记录微电极的电极电阻。显微镜观察下,使用微操纵仪将微电极推向细胞直至紧贴于细胞表面,同时持续观测微电极电阻的变化,等待细胞与微电极封接,当阻抗大于1 GΩ 时,记录微电极接触细胞后的巨阻封接形成时间,稳定1 min后使用负压破膜,补偿电容电流和串联阻抗(40%以上)后形成全细胞记录模式,同时记录串联阻抗以及膜电容,期间间断使用“Y-tube”系统持续灌流细胞,灌流速度保持在3 ml/min[11]。

1.6 自发动作电位记录 hiPSC-CMs自发动作电位的记录采用电流钳(gap-free)模式[700B 膜片钳放大器(Axon公司,美国)和Digidata 1 550 A 膜片钳数模转换器(Axon公司,美国)];记录动作电位信号的采样频率为1 k Hz,低通Bessel滤波频率为0.5 k Hz[9]。记录到自发动作电位后稳定1 min,再记录自发动作电位的频率、静息电位、阈电位、振幅、最大去极化速率、复极时间(30%、40%、70%、80%和90%动作电位时程)[12]、超极化电位和最大自动除极速率。

1.7 统计学处理 采用Clampfit 10.5和Origin 8.0软件对数据资料进行分析。正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间的比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 hiPSC-CMs的分子生物学鉴定 免疫荧光鉴定显示hiPSC-CMs高表达心肌细胞特异性标志物肌钙蛋白c TNT 以及肌动蛋白α-actin。

图1 hiPSC-CM 细胞特异性标志物鉴定

2.2 显微镜下hiPSC-CMs消化前后的形态变化显微镜下肉眼观察,hiPSC-CMs消化前呈圆柱状,有分支,紧密贴附在培养皿中,融合和分离的细胞同时可见自发收缩;Accutase酶消化0.5 min(A 组)、1 min(B组)、2 min(C组)后细胞自发收缩减弱,细胞形态未见明显变化,使用动作电位外液冲洗后,A、B、C组细胞呈圆形或椭圆形,显微镜下折光度增强,单个细胞逐渐恢复跳动。而消化5 min(D 组)、10 min(E组)后细胞自发收缩不明显,细胞逐渐变成圆形或椭圆形,使用动作电位外液冲洗后,细胞进一步变圆,部分细胞破碎,显微镜下观察未能恢复明显的自发跳动(图2)。

图2 不同消化时间下的显微镜下hiPSC-CM 形态(10×10倍)

2.3 hiPSC-CMs电 生 理 记 录 Accutase 酶 消 化后,各组全细胞记录模式建立前的细胞膜电容及串联电阻无统计学差异(P＞0.05)(表1)。相比A 组(0.5 min),其他组更易找到合适的细胞形成巨阻封接,容易破膜,随着消化时间延长巨阻封接形成时间变短(P＜0.05)(表1)。

表1 各组巨阻封接形成时间、膜电容以及串联电阻

2.4 hiPSC-CMs自发动作电位参数 hiPSC-CMs动作电位有明显平台期,30%至40%动作电位时程之差与70%至80%动作电位时程之差的比值(APD30-40/APD70-80)均大于1.5(表2),提示为心室肌样细胞(图3)[12]。随着消化时间的延长,hiPSCCMs自发动作电位的频率有增快趋势(P＜0.01)、振幅逐渐减小趋势(P＜0.01)(表2)。尽管无统计学意义(P＞0.05),随着消化时间的延长,hiPSCCMs自发动作电位的最大去极化速率在数值上有降低趋势(表2)。

图3 不同消化时间记录的动作电位

表2 各组hiPSC-CMs自发动作电位的电生理参数

3 讨论

本研究显示,Accutase酶预先处理hiPSC-CMs 1 min可有效的建立全细胞模式进行电生理记录。消化时间过短或不消化,hiPSC-CMs分离不充分,成团细胞较多,同时易激惹,细胞间相互影响且跳动幅度较大,不易寻找合适的单细胞,并且不易形成封接及破膜难度大;而进一步延长消化时间则在一定程度上影响hiPSC-CMs的活性,改变记录的自发动作电位形态,影响hiPSC-CMs成熟度的电生理评价。

hiPSC-CMs的制备研发过程根据细胞不同成熟水平使用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、EDTA、Tryp LETMExpress等[13]。Accutase酶常用于分离干细胞,同时具有胶原酶和蛋白酶的活性。相较胰蛋白酶,Accutase酶作用温和,消化时间要求相对宽松,分离细胞时对细胞表面损伤相对较小且消化较彻底。研究表明,Accutase酶用于神经干细胞的分离培养,与胰酶同期相比有神经球直径更大、细胞形态及功能损伤小、存活率高的优势[14],在人胚胎干细胞分离传代中使用具有不产生异种分化、对单细胞的活力及增殖影响小的特点[15],但未在电生理水平上进行对比。近年来,Accutase酶已经在hiPSCCMs的传代和制备中应用[3]。本研究将Accutase酶用于hiPSC-CMs细胞电生理评价前的准备,在进行膜片钳实验前无需严格控制细胞处于低密度状态培养。Accutase酶处理后的细胞肉眼下观察其自发跳动减弱,但其自发动作电位仍可被记录。在保证细胞基本活性的前提下,使用Accutase酶预先消化hiPSC-CMs,可使细胞收缩变圆,细胞膜变薄更易于建立全细胞模式。本研究显示Accutase酶处理1 min形成巨阻封接的时间是(2.10±0.55)min,显著低于未消化直接封接的时间(大部分细胞不能形成巨阻封接或破膜失败)或消化0.5 min组(4.80±1.10)min,消化1 min对细胞形态也影响较小,另外随着消化时间的延长,形成巨阻封接时间相对减少,但能保持稳定记录动作电位的细胞变少。

研究显示,hiPSC-CMs在构建心脏疾病模型,评价药物毒性反应和心肌修复等方面日益受到关注,但与正常人体心肌细胞相比仍有差距[1]。故促进hiPSC-CMs更成熟,缩小其与正常人体心肌细胞的差距已成为目前该领域的研究热点。目前报道的促进hiPSC-CMs更加成熟的方法有延长培育时间、外加电机械刺激、生化因子干预以及与非心肌细胞共培养等[5]。相对成熟的hiPSC-CMs电生理检测表现为更低的超极化电位、更慢的自发跳动节律、具有更明显的平台期,对儿茶酚胺类药物具有更好的反应性[16]。本研究所记录细胞的自发动作电位均具有平台期,APD30-40/APD70-80＞1.5提示为心室肌样hiPSC-CMs[12]。目前报道的hiPSC-CMs心室肌样细胞超极化电位在-30～-75 m V,0期最大去极化速率在2 000～15 000 m V/s,自发动作电位的频率在5～85 次/分,动作电位的振幅在79～112 m V[2,8,16]。本研究采用同一培养环境和同一培养周期的hiPSC-CMs,减少了培养条件和时间的影响,其中A、B、C、D、E 组hiPSC-CMs动作电位参数与上述研究结果相符。结合Robertson 等[16]提出的将hiPSC-CMs依据成熟度分为早期的hiPSCCMs和晚期的hiPSC-CMs,D、E 组hiPSC-CMs动作电位的参数更接近早期的hiPSC-CMs,说明延长Accutase酶消化时间对其动作电位形态可能有一定的影响。

本研究所选细胞培养时间为28～32天,而培养时间是影响hiPSC-CMs 成熟度的一个重要因素[16],培养时间更长的细胞可能存在不同的研究结果。研究显示hiPSC-CMs培养一周左右即可出现自发收缩,包含不同类型的细胞,如心室肌样细胞,心房肌样、窦房结样细胞[12]。笔者前期研究显示,培养30天左右的hiPSC-CMs,在全细胞模式下的动作电位形态基本属于心室肌样细胞,其他类型的心肌细胞极少,故笔者选择了培养28～32天的细胞进行研究。同时由于未将细胞控制在低密度状态,细胞密度相对较高,细胞间连接更紧密,故在未消化状态直接进行膜片钳实验绝大部分细胞不能形成巨阻封接或破膜失败,未记录到相应动作电位。另外本研究显示随着消化时间延长,hiPSC-CMs的自动除极速率加快。目前认为自律细胞的自动除极可能与起搏电流或细胞内周期性的钙释放有关[4],Accutase酶是否对起搏电流或细胞内周期性的钙释放有作用,还有待进一步的研究。Accutase酶与胰蛋白酶相比,两者对hiPSC-CMs在细胞电生理水平的影响是否有区别,目前尚未进行比较。本研究探究了Accutse酶预处理hiPSC-CMs进行膜片钳纪录的合适的消化时间,可为后续相关实验做准备。有研究表明胰蛋白酶对动物心肌细胞消化传代处理后对心肌表面的KATP通道有一定影响[17],而accutase酶未有影响离子通道的相关报道,需要未来更多的研究和实验数据来探究。