李璐，王凡，姚小艳，刘珍，

1 同济大学附属第一妇婴保健院检验科，上海 200092；2 上海市浦东医院/复旦大学附属浦东医院检验科

非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）是呼吸系统最常见的肿瘤，近年来由于早期手术、靶向药物及免疫疗法等综合疗法的应用，患者预后有一定改善，但其在恶性肿瘤中的死亡率仍居第一位［1］。肿瘤细胞早期侵袭和转移是影响NSCLC预后的关键因素，因此探索NSCLC 发生侵袭、转移的作用及机制，寻求新的治疗靶点具有重要的临床意义。同源性磷酸酶张力蛋白（Phosphatase and Tensinhomology，PTEN）作为抑癌基因，其在多种肿瘤中表达减少或缺失，且与肿瘤的侵袭与转移密切相关［2］。基质金属蛋白酶2（Matrix MetalloProteinase-2，MMP-2）可依赖锌离子降解基底膜及结缔组织等细胞外间质，为肿瘤浸润和转移打开缺口［3］。研究［4］报道，MMP-2在多种肿瘤组织中呈高表达，且与临床分期、病理学分级、淋巴结转移相关。TIAN等［5］在肝癌细胞中过表达PTEN 可抑制MMP-2 的表达，从而抑制肝癌细胞的侵袭和转移。因此，我们认为有必要开展PTEN 与MMP-2 在NSCLC 淋巴结侵袭中的作用与分子机制的研究。2021 年3 月1 日—2022 年3 月5 日，本研究观察了PTEN、MMP-2 在淋巴结侵袭性NSCLC 细胞株H1299 中的表达变化，并探讨其分子调控机制，为研究NSCLC 发生淋巴结侵袭提供了一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 NSCLC 细胞株、试剂及仪器 淋巴结侵袭性NSCLC 细胞株H1299、淋巴结非侵袭性NSCLC 细胞株A549 及人胚肾细胞293T 均购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、RPMI-1640 及DNEM 培养基、青霉素-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶均购自美国HyClone 公司；RNA 逆转录试剂盒和SYBR Green Ⅰ试剂盒均购自日本Ta-KaRa 公司；MMP-2、Akt、p-Akt、PTEN 抗体购于美国CST 公司，GAPDH 抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自上海爱必信（上海）生物科技有限公司；RIPA 细胞裂解液（中）、Dual-LumiTM双荧光素酶报告基因检测试剂盒、PMSF 及BCA 蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术公司；PTEN、MMP-2 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Lipofectamine 3000 转染试剂盒购于美国Invitrogen 公司。ECL 化学发光试剂盒购于美国Millipore 公司，质粒psin-PTEN（过表达PTEN）、质粒psin-vector（空载对照）、包装质粒psPAX2 及pMD2. G、pGL4.27［1uc2P/NFκb-RE/Hygro］质粒（pGL4.27-NF-κb）购于美国Addgene 公司。细胞培养箱购自美国Thermo 公司，生物安全柜购自海尔公司，垂直电泳仪/转印仪购自美国Bio-Rad 公司，Fusion FX7 化学发光成像系统购自法国Vilber-Lourmat公司，微量移液器购自美国Thermo公司，Light Cycler480 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR）系统购自瑞士罗氏公司，多功能酶标仪购自美国Bio-Rad 公司，美国普通显微镜、荧光倒置显微镜购自日本Nikon 公司，ND2000 超微量核酸蛋白测定仪购自美国Thermo公司。

1.2 H1299 细 胞 和A549 细 胞 中PTEN、MMP-2 mRNA及蛋白检测

1.2.1 H1299 细胞和A549 细胞中PTEN、MMP-2 mRNA 检测 采用RT-qPCR 法。取H1299 细胞和A549 细胞继续培养24 h 后，TRIzol 法提取细胞总RNA，采用PrimeScript 反转录试剂盒合成cDNA，采用2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒及特异性引物，按照说明书要求在冰上于八连管中配制10µL 体系反应混合液，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）5 µL、PCR 前 后 引 物（终 浓 度 为0.4µmol/L）各0.4µL、去RNA 酶的双蒸水3.2µL、cDNA 模板（＜100 ng）1 µL。PTEN 正向引物序列为5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′，反向引物序 列 为5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′；MMP-2 正 向 引 物 序 列 为 5′-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT-3′，反 向 引 物 序 列 为 5′-CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3′；β-actin 正向引物 序 列 为5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，反 向 引 物 序 列 为5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。设置Light Cycler480 System两步法PCR 扩增标准程序，反应结束后拷贝溶解曲线、扩 增 曲 线 及Ct 值，以2-ΔΔCt表 示 细 胞 中 目 的 基因mRNA的相对表达量。

1.2.2 H1299 细胞和A549 细胞中PTEN、MMP-2 蛋白检测 采用Western Blotting 法。取H1299细胞和A549 细胞继续培养24 h 后，1×PBS 洗细胞两次，冰上操作，加入PIPA 细胞裂解液（加入PMSF）充分裂解，采用BCA 法对蛋白定量，分装保存于-20 ℃备用。取等量蛋白样品（50µg）进行100 ℃加热5 min，于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳（恒压80 V、20 min，120 V、90 min），结束后将蛋白凝胶转至0.4µm硝酸纤维素膜上（100 V，90 min）；5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST 漂洗3 次后，4 ℃过夜孵育一抗，TBST 漂洗3 次后，室温孵育二抗2 h，其中抗体用含5% BSA 的TBST 溶液配制，体积比为1：1 000，TBST漂洗3 次后配制化学发光液，等量A 液和B 液在EP管中混匀，避光，将显影液均匀滴加在膜上，在化学发光仪上选择自动曝光或手动曝光显影，保存图像结果为JEPG 格式。以GAPDH 作为内参，通过Image J软件分析条带灰度值，以目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 质粒转染及细胞分组 采用慢病毒介导的脂质体转染技术。取过表达PTEN 的质粒psin-PTEN、空载对照质粒psin-vector 及包装质粒psPAX2、pMD2.G，扩增抽提后接种293T细胞，按照转染试剂盒说明书要求，将质粒、包装质粒、Lipo3000 及Opti-MEN 按照特定比例进行转染，48 h 后收集病毒上清过滤后保存于-80 ℃备用。取H1299 细胞，按每孔4×105个接种于六孔板中，培养24 h 后，每孔加入3 mL病毒上清、1 mL完全培养基、4µL Polybrene（终浓度5 ng/mL），混匀后置培养箱中，孵育12 h 后更换新鲜完全培养基4 mL 继续培养48 h，使用荧光显微镜及Western blotting 法验证其过表达效果，建立过表达PTEN 的H1299 细胞，记为PTEN 过表达组，以转染空载质粒的H1299细胞为对照，记为对照组。

1.4 两组细胞中PTEN 蛋白、MMP-2 mRNA 及蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白检测 两组细胞中MMP-2 mRNA 检测方法同“1.2.1”。两组细胞中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白检测方法同“1.2.2”。

1.5 两组细胞中转录因子NF-κb 检测 采用荧光素酶报告基因实验。取两组细胞悬液接种至96孔 板 中，继 续 培 养24 h，将pGL4.27-NF-κb 质粒、Lipo3000 及Opti-MEN 按照特定比例进行转染，4 h 后换液继续培养24 h，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求配制检测工作液，与96孔板中的细胞培养液混匀后室温孵育10 min，采用多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶荧光强度，以荧光素酶的荧光强度表示转录因子NF-κb活性。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 7.0 软件。计量资料以±s表示，比较用t检验；P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H1299 细 胞 和A549 细 胞 中PTEN、MMP-2 mRNA及蛋白相对表达量比较

2.1.1 H1299 细胞和A549 细胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相对表达量比较 H1299 细胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相 对 表 达 量 分 别 为0.69 ± 0.10、5.88±0.79，A549细胞中PTEN、MMP-2 mRNA 相对表达量分别为1.00±0.01、1.00±0.02，两者相比，P均＜0.01。

2.1.2 H1299 细胞和A549 细胞中PTEN、MMP-2 蛋白相对表达量比较 H1299细胞中PTEN、MMP-2蛋白相对表达量分别为0.62 ± 0.03、1.23 ± 0.09，A549细胞细胞中PTEN、MMP-2蛋白相对表达量分别为1.81±0.16、0.67±0.05，两者相比，P均＜0.01。

2.2 两组细胞中PTEN 蛋白、MMP-2 mRNA 及蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白相对表达量比较 PTEN 过表达组细胞中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、Akt 蛋白、p-Akt 蛋白相对表达量分别为3.14 ± 0.31、0.54 ±0.04、2.04 ± 0.21、0.21 ± 0.01，对 照 组 细 胞 中PTEN 蛋白、MMP-2 蛋白、AKT 蛋白、p-Akt 蛋白相对表 达 量 分 别 为0.60 ± 0.01、0.81 ± 0.02、1.99 ±0.12、0.74 ± 0.03，与对照组相比，PTEN 过表达组细胞中PTEN 蛋白相对表达量显著增高（P＜0.01），MMP-2 蛋白及p-Akt 蛋白相对表达量显著降低（P均＜0.01）。PTEN 过表达组细胞中MMP-2 的mRNA相对表达量为0.63 ± 0.01，对照组细胞中MMP-2的mRNA 相对表达量为1.00 ± 0.01，两组相比，P＜0.01。

2.3 两组细胞中转录因子NF-κb 活性比较 PTEN过表达组细胞中NF-κb 活性为0.05 ± 0.01，对照组细胞中NF-κb 活性为1.00 ± 0.02，两组相比，P＜0.01。

3 讨论

淋巴结侵袭是NSCLC 最常见的转移途径，既往研究［6］发现，有淋巴结侵袭的NSCLC 患者复发风险是无淋巴结侵袭患者的两倍，淋巴结侵袭的NSCLC患者5年生存率及总生存率明显低于无淋巴结侵袭患者。由此可见，深入研究影响NSCLC 细胞发生侵袭的因素对改善NSCLC 预后及提高患者生存率有十分重要的意义。

PTEN 是第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，在结直肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达减少或缺失，PTEN 与肿瘤的发生、发展以及侵袭转移密切相关［7-8］。MMP-2 是分布最广的基质金属蛋白酶之一，可降解细胞外基质获得向周边组织侵袭和转移的能力，当细胞恶变时常伴有MMP-2的表达增强。多项研究［9-11］结果显示，MMP-2与肿瘤的新血管形成、浸润和转移关系密切。基于既往研究，我们探索NSCLC 中发生淋巴结转移时PTEN 对MMP-2 表达的调控。我们在细胞学实验中发现，淋巴结侵袭性NSCLC 细胞株H1299 与淋巴结非侵袭性细胞株A549 相比较，PTENmRNA 及蛋白呈低表达，而MMP-2 呈高表达；而当H1299 细胞中PTEN 被过表达时，MMP-2 的mRNA 和蛋白表达则降低，这些结果均表明NSCLC 中PTEN 可负向调控MMP-2。

PI3K/PTEN/AKT 信号通路在肺癌的发生发展中具有重要作用，磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）作为一种磷脂酰肌醇激酶，可特异性磷酸化细胞膜的磷脂酰肌醇成分，生成磷脂酰肌醇2磷酸［phosphatidylinositol（4，5）bisphosphate，PIP2］和磷脂酰肌醇3 磷酸［phosphatidylinositol（3，4，5）bisphosphate，PIP3］，PTEN 蛋白通过使PIP3 去磷酸化形成PIP2 失去信使功能阻断PI3K 对AKT 的活化进程，从而下调通路活性，负性调节细胞生长、抑制肿瘤的浸润与转移［12］。陈翔等［13］发现，PTEN 可以通过抑制AKT调节MMPs表达，进而调节肿瘤细胞的迁徙和转移。我们通过Western Blotting实验发现，在PTEN 高表达的H1299 细胞中p-Akt 及MMP-2 的表达降低。我们的实验结果与文献研究一致，提示淋巴结侵袭性NSCLC 细胞中Akt 信号通路活化参与PTEN蛋白负调控MMP-2的表达。

NF-κb 是一种广泛存在的真核细胞转录因子，PI3K/AKT/NF-κb 信号通路不仅可调控细胞增殖、分化和凋亡，其异常活化还与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤细胞的发生及转移过程中NF-κb 活性明显增强［14］。在典型的NF-κb 活化途径中，细胞受外界信号或致癌因素刺激时，特定位点上的丝氨酸残基被磷酸化，随后释放出大量NF-κb，NF-κb 转入细胞核与特定序列DNA 结合并启动基因的转录，活化的NF-κb 可有效介导转录以抑制肿瘤细胞凋亡，肿瘤细胞的浸润和侵袭随之增加［15］。我们通过荧光素酶报告基因实验检测侵袭性NSCLC 细胞H1299中PTEN 被过表达时NF-κb 的活性，发现淋巴结侵袭性NSCLC细胞中PTEN可以抑制NF-κb的活性。

本研究尚存在一定的不足。首先，PTEN 负调控MMP-2 后产生的生物学效应仍需进一步求证；其次，当NSCLC 发生淋巴结侵袭时PTEN 所受的表达调控仍需进一步研究。因此，我们将来会进一步探索淋巴结侵袭性NSCLC 中PTEN 上游的调控机制及其负调控MMP-2后的效应。

综上所述，淋巴结侵袭性NSCLC 细胞株H1299中PTEN 表达降低、MMP-2 表达升高，过表达PTEN可能是通过Akt/NF-κb 信号通路抑制MMP-2 的表达，这为进一步深入研究淋巴结侵袭性NSCLC 的分子靶标及效应提供了一定的理论依据。