宋 歌，夏 娇，肖 强*

(1.湖北民族大学 林学园艺学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

目前已有大量关于黄精化学成分的研究，其主要化学成分包括甾体皂苷类、多糖类、黄酮类、生物碱类、挥发油等[3]，具有增强免疫、降血糖、保肝、抗肿瘤、抗炎等作用[4].已有关于湖北黄精根部皂苷成分生物活性的研究[5-6]，但针对湖北黄精叶片挥发油成分的研究仍较少.因此本研究选取湖北黄精叶片作为研究对象，能对湖北黄精植株不同部位挥发油成分及特性的研究进行补充.

挥发油常见的提取方法有水蒸气蒸馏法、超临界CO2萃取法、超声波辅助提取法、同时蒸馏萃取法等[7].其中，同时蒸馏萃取法是将含有样品组分的水蒸气和萃取溶剂蒸汽混合、冷凝，通过反复循环实现高效萃取[8]；此方法操作简便，设备简单，具有良好的重现性和较高的萃取率[9].超临界CO2萃取法使用超临界流体作溶剂，能对温度和压力均高于临界点的流体进行物质提取和分离[10]，具有防止氧化、热解及保持生物活性等优点.本文将利用这2种方法中提取介质和作用机理的不同，对比分析2种提取方式在所提取成分的组成、抗氧化活性方面的影响，以探索相对更具优势的提取方式，为湖北黄精生产中叶片副产物的深入研究及开发利用提供依据.

1 材料与仪器

1.1 实验材料与试剂

实验样品产自湖北省恩施市高桥坝基地，为种植4～5 a的无病斑无虫害湖北黄精新鲜叶片，于2021年10月初采集，先在阴凉处室温干燥，之后低温粉碎备用.

实验试剂包括石油醚、无水硫酸钠、抗坏血酸(Vc)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、过硫酸钾、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS).

1.2 实验仪器

包括气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司，6890N-5975C)、快速低温冷却循环机(宁波新芝生物科技股份有限公司，DKL-5010)、旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA)、紫外-可见光分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司，TU-1901).

2 实验方法

2.1 湖北黄精叶片挥发油的2种提取方法

同时蒸馏萃取法：将湖北黄精叶片粉末置于同时蒸馏萃取装置中，加入去离子水，加热保持溶液沸腾；装置另一端连接装有石油醚的圆底烧瓶，并连接快速低温冷却循环机，将温度设置为40 ℃，提取6 h，取出；接着去除馏出液中的残余水分并浓缩，用棕色瓶收集后密封并放入冰箱，4 ℃条件下保存备用.

(2)培养基。菌株CEH-ST79的保存、活化及发酵采用ATCC213 改良培养基[7]，马铃薯干腐病病原菌的培养采用PDA培养基[9]。

超临界CO2萃取法：称取300 g湖北黄精叶片粉末置于超临界萃取罐中.设置萃取条件为：35 ℃，3 500 psi，静态萃取3 h，动态萃取3 h；收集萃取后的挥发油，放入冰箱并在4 ℃条件下保存备用.

2.2 湖北黄精叶片挥发油GC-MS条件及成分分析

2.2.1 气相色谱条件 色谱柱柱温为70 ℃，进样口温度为280 ℃，柱内载气流量为60 mL/min，载气为高纯He.升温程序为：从70 ℃开始保持2 min；以10 ℃/min的速度升至255 ℃，保持25 min；再以10 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min.

2.2.2 质谱条件 采用EI离子源(电子轰击源)，电离电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，质量范围为30～550 AMU.

2.2.3 定性和定量分析 将实验得到的质谱图用NIST标准质谱库进行分析，通过与标准图谱对照，得出2种方法提取的挥发油样品主要成分.之后利用图谱上的峰面积，使用归一化法计算各成分的相对百分含量.

2.3 湖北黄精叶片挥发油的抗氧化活性测定

2.3.1 DPPH自由基清除率测定 参照Cai等[11]的方法，将提取的湖北黄精叶片挥发油用无水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL质量浓度梯度的样品溶液；取2 mL样品溶液并加入5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，混匀，室温下避光反应30 min，最后于517 nm波长处测定吸光度Am；再以2 mL无水乙醇替代DPPH溶液并测定吸光度At1，以2 mL无水乙醇替代样品溶液测定吸光度A01.平行测定3次，并以Vc作为阳性对照，按式(1)计算清除率.

(1)

2.3.2 羟基自由基清除率测定 参照吴颖等[12]的方法，将提取的湖北黄精叶片挥发油用无水乙醇配置成50、100、150、200、250 μg/mL质量浓度梯度的样品溶液；取1.6 mL样品溶液依次加入6 mmol/L的FeSO40.4 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，9 mmol/L水杨酸溶液1 mL，于37 ℃条件下水浴加热15 min，最后于510 nm处测定样品吸光度An；再用1.6 mL去离子水代替样品溶液测定吸光度A02，以1 mL蒸馏水替代H2O2溶液测定吸光度At2.平行测定3次，并以Vc作为阳性对照，按式(2)计算清除率.

(2)

2.3.3 超氧阴离子自由基清除率测定 参考吴颖等[12]的方法，将提取的湖北黄精叶片挥发油用无水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL质量浓度梯度的样品溶液，取1 mL样品溶液，依次加入50 mmol/L Tris-缓冲液(pH=7.4)1.4 mL，5 mmol/L邻苯三酚溶液0.2 mL，混匀后静置5 min，最后在320 nm波长下测定吸光度Ay；再以10 mmol/L盐酸溶液0.2 mL替代邻苯三酚溶液并测定吸光度At3，以1 mL去离子水替代样品溶液并测定吸光度A03.平行测定3次，并以Vc作为阳性对照，按式(3)计算清除率.

(3)

2.3.4 ABTS自由基清除率测定 ABTS溶液需用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.700±0.020，即得到ABTS工作液[13].将提取的湖北黄精叶片挥发油用无水乙醇配制成100、200、300、400、500 μg/mL质量浓度梯度的样品溶液，取1 mL样品溶液并加入3 mL ABTS工作液，摇匀后，室温避光保存10 min，最后在734 nm波长下测定吸光度Az；再以1 mL无水乙醇替代样品溶液并测定吸光度A04，以3 mL无水乙醇替代ABTS工作液并测定吸光度At4.平行测定3次，并以Vc作为阳性对照，按式(4)计算清除率.

(4)

3 结果与分析

3.1 同时蒸馏萃取法及超临界CO2萃取法提取湖北黄精叶片挥发油GC-MS结果

由图1和表1可知，同时蒸馏萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油共鉴定出26种化合物.含量超过10%的有3种，其中2，3-二氢苯并呋喃含量最高(46.63%)，其次是α-亚麻酸(18.40%)和棕榈酸(13.27%)，占挥发油总成分的78.0%.含量在1%～10%之间的有4种，分别是4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(8.63%)、植物醇(2.08%)、2，6-二叔丁基对甲酚(2.05%)和苯乙醛(1.02%).其余19种化合物含量均在0.1%～1.0%之间.

由图2和表2可知，超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油共鉴定出19种化合物.含量超过10%的有3种，其中α-亚麻酸含量最高(37.77%)，其次是(3β，24S)-柱头甾-5-烯-3-醇(12.29%)和10-十九烷醇(11.34%)，占挥发油总成分的61.40%.含量在1%～10%之间的有14种，有棕榈酸(6.41%)、芥酸酰胺(6.37%)、植物醇(4.08%)、天然维生素E(3.31%)、正二十烷(2.65%)、豆甾醇(1.89%)、(9Z，12Z，15Z)-9，12，15-十八碳三烯-1-醇(1.79%)、(Z，Z)-七烷-1，8，11-三烯(1.77%)等.其余2种化合物含量在0.5%～1.0%之间.

表1 湖北黄精叶片挥发油成分及相对含量(同时蒸馏萃取法)Tab.1 Volatile components and relative contents from the leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.(simultaneous distillation extraction)

表2 湖北黄精叶片挥发油成分及相对含量(超临界CO2萃取法)Tab.2 Volatile components and relative contents from the leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.(supercritical CO2 extraction)

3.2 同时蒸馏萃取法及超临界CO2萃取法提取湖北黄精叶片挥发油成分对比分析

由表3可见，同时蒸馏萃取法和超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油成分中，均含有酸类、酚类、醇类、酯类、酮类和烯烃类化合物.呋喃类是同时蒸馏萃取法提取的挥发油中含量最高的化学成分(46.63%)，酸类是超临界CO2萃取法提取的挥发油中含量最高的化学成分(44.18%).同时蒸馏萃取法提取的挥发油中化合物种类数大于超临界CO2萃取法，化合物种类更加丰富.

3.3 同时蒸馏萃取法及超临界CO2萃取法提取湖北黄精叶片挥发油抗氧化活性分析

3.3.1 DPPH自由基清除能力 由图3(a)可知，在100～500 μg/mL质量浓度范围内，同时蒸馏萃取法和超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油对DPPH自由基都具有清除作用，且清除能力随质量浓度递增均呈增强的趋势.采用同时蒸馏萃取法提取的挥发油清除DPPH自由基的IC50为192.94 μg/mL，超临界CO2萃取法提取的挥发油清除DPPH自由基的IC50为342.28 μg/mL，Vc对照组的IC50为178.45 μg/mL.同时蒸馏萃取法提取的挥发油抗氧化能力显著高于超临界CO2萃取法，但抗氧化效果稍弱于Vc对照组.

3.3.2 羟基自由基清除能力 由图3(b)可知，2种萃取方式提取的湖北黄精叶片挥发油对羟基自由基均有较好的清除效果，且有浓度依赖效应；但二者都低于Vc对羟基自由基的清除率.同时蒸馏萃取法提取的挥发油清除羟基自由基的IC50为112.38 μg/mL，超临界CO2萃取法提取的挥发油清除羟基自由基的IC50为193.64 μg/mL，Vc对照组的IC50为52.41 μg/mL.同时蒸馏萃取法提取的挥发油对羟基自由基清除能力显著高于超临界CO2萃取法.

表3 不同提取方式提取湖北黄精叶片挥发油成分对比Tab.3 Comparison of volatile components extracted from leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.by different extraction methods

3.3.3 超氧阴离子自由基清除能力 由图3(c)可知，湖北黄精叶片挥发油和Vc在邻苯三酚自氧化化学体系中均能在一定程度上清除超氧阴离子，且清除率随挥发油质量浓度的增加呈上升趋势，但都低于Vc.同时蒸馏萃取法提取的挥发油清除超氧阴离子自由基的IC50为237.61 μg/mL，超临界CO2萃取法提取的挥发油清除超氧阴离子自由基的IC50为322.15 μg/mL，Vc对照组的IC50为72.46 μg/mL.

3.3.4 ABTS自由基清除能力 由图3(d)可知，在0～500 μg/mL质量浓度区间内，湖北黄精叶片挥发油对ABTS自由基清除率随着质量浓度的增加而提高，但清除率低于Vc.同时蒸馏萃取法提取的挥发油清除ABTS自由基的IC50为371.44 μg/mL，超临界CO2萃取法提取的挥发油清除ABTS自由基的IC50为416.63 μg/mL，Vc

图3 湖北黄精叶片挥发油抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of volatile oil from leaves of Polygonatum zanlanscianense Pamp.

清除ABTS自由基的IC50为147.36 μg/mL.总体而言，同时蒸馏萃取法提取的挥发油对ABTS自由基的清除活性大于超临界CO2萃取法.

4 讨论

采用同时蒸馏萃取法和超临界CO2萃取法提取湖北黄精叶片挥发油，并通过GC-MS方法鉴定出同时蒸馏萃取法提取的挥发油中有26种化合物成分，包含12种类别，主要成分为呋喃、酸以及酚类化合物，占挥发油总组分的90%以上；超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油共鉴定出19种化合物，包含9种类别，主要成分为酸、醇类化合物，占挥发油总组分的80%以上.余红等[14]测定的多花黄精根状茎挥发油成分中，与本实验测得的相同成分有正十二烷、2，6-二叔丁基对甲酚、邻苯二甲酸二丁酯，其他成分在本实验中未检出；这可能与黄精品种、测定部位、采集季节、挥发油提取方法和成分分析方法等因素有关.本研究初步鉴定了湖北黄精叶片挥发油的主要成分，为湖北黄精叶片的提取和利用提供了理论依据.

超临界CO2萃取法所需的温度低、时间短、且在密闭的提取系统中进行,可避免一些易氧化或易发生见光反应的化学成分的损失，同时又适用于脂溶性、低沸点、热敏性物质的提取[15].研究表明，烃类、酯类、部分醇类化合物在超临界CO2流体中的溶解度较大[16]，因此本研究中超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油中检测出了同时蒸馏萃取提取的挥发油中未检测出的烷烃类物质(正二十烷、正二十七烷、十三烷)，且烯烃、醇类和酯类物质的含量高于同时蒸馏萃取提取的挥发油.但超临界CO2萃取法提取的挥发油化合物种类比较有限，同时蒸馏萃取法提取的挥发油中的化合物种类数更多.

此外，对2种提取方法得到的挥发油分别进行抗氧化活性测定.采用同时蒸馏萃取提取的挥发油抗氧化活性略高于CO2超临界萃取法提取的挥发油.这种抗氧化活性的差异可能与2种提取方式提取的挥发油成分不同有关，不同结构和性质的化合物的抗氧化作用不同[17].酚类物质具有清除自由基的作用，是很强的体外抗氧化剂；而本实验中同时蒸馏萃取法提取的挥发油中酚类含量(12.12%)远大于超临界CO2萃取法(0.62%)，故推测超临界CO2萃取法提取的挥发油整体抗氧化性较差，与实验结果一致.

5 结论

通过GC-MS方法初步对比分析了同时蒸馏萃取法和超临界CO2萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油成分，结果表明2种方法提取到的挥发油种类与含量差异较大；采用同时蒸馏萃取法提取的湖北黄精叶片挥发油成分和种类更多.测定湖北黄精叶片挥发油对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基的清除能力，结果表明在一定的质量浓度范围内，湖北黄精叶片挥发油具有一定的抗氧化活性，同时蒸馏萃取法比超临界CO2萃取法提取的挥发油成分抗氧化活性更高，证明同时蒸馏萃取法提取湖北黄精叶片挥发油更具优势.另外，同时蒸馏萃取法能避免超临界CO2萃取法设备投资费用大、工艺技术要求高的问题，但投入实际生产应用还需要开展更深入的研究.