杨双，俞思全

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，早期临床特征不典型、诊断难度大，多数病人确诊时已经发展至中晚期、部分病人错过了手术切除的时机，通过放化疗虽然能够杀伤癌细胞、缩小瘤体体积、延长生存时间，但病人的总体预后仍较差、5年生存率不理想［1-2］。近年来，中药的抗癌作用受到越来越多关注，多种中药材的活性成分被证实能够抑制癌细胞的恶性生物学行为。紫草素是中药紫草中的活性成分，已有研究表明紫草素对胃癌、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、细胞周期具有调控作用［3-5］。食管癌的发生发展与癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的失控密切相关，但紫草素是否调控食管癌细胞的上述恶性生物学行为尚未明确。基于此，本研究将以食管癌Eca109细胞为对象，在2019年1月至2020年6月开展细胞实验，具体分析紫草素促进细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用及机制，旨在为今后研究食管癌新的治疗药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料食管癌Eca109细胞购自ATCC公司，紫草素、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）购自Sigma公司，Annexin V凋亡检测试剂盒［异硫氰酸荧光素（FITC）∕碘化丙啶（PI）双染法］购自上海生工公司，细胞周期检测试剂盒购自南京建成研究所，RIPA裂解液购自上海碧云天公司，活化胱天蛋白酶（cleaved caspase-3）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、磷酸化磷酸肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体购自Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组给药Eca109细胞在含有10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）中贴壁培养，0.25%胰蛋白酶消化后在培养板中传代培养，待细胞密度长至80%～90%后进行分组给药。对照组用不含药物的DMEM处理，紫草素组用含有0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素的DMEM处理，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组用含有2.0 μmol∕L紫草素和10 μg∕L IGF-1的DMEM处理，每个处理调节设置5个复孔，连续处理24 h。

1.2.2 细胞凋亡率检测取“1.2.1”中分组处理后的细胞，调节细胞密度至2×105∕mL，按照Annexin V凋亡检测试剂盒（FITC∕PI双染法）进行操作，分别孵育Annexin V-FITC和PI，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.2.3 细胞周期检测取“1.2.1”中分组处理后的细胞，调节细胞密度至5×105∕mL，用-20℃无水乙醇固定过夜，次日按照细胞周期检测试剂盒进行操作、孵育PI后在流式细胞仪上检测细胞周期。

1.2.4 蛋白表达量检测取“1.2.1”中分组处理后的细胞，加入RIPA裂解液、提取细胞中的蛋白，将蛋白样本与上样缓冲液混合，加入SDS-PAGE后电泳，电转移至PVDF膜。在室温用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h，在4℃用1∶1 000稀释的cleaved caspase-3、cyclin D1、p-PI3K、p-AKT抗体或1∶5 000稀释的β-actin抗体孵育PVDF膜过夜；洗膜3遍后，在室温用1∶1 000稀释的HRP二抗孵育PVDF膜1 h，最后在凝胶成像系统中得到蛋白条带，扫描条带灰度值并以β-actin为内参计算cleaved caspase-3、cyclin D1、p-PI3K、p-AKT的表达量。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件录入数据并进行统计分析，五组间计量资料的比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对Eca109细胞凋亡率的影响与对照组比较，0.5 μmol∕L紫草素组、1.0 μmol∕L紫草素组、2.0 μmol∕L紫草素组Eca109细胞的凋亡率明显增加（P＜0.05）且随着紫草素剂量增加，细胞的凋亡率也相应增加；与2.0 μmol∕L紫草素组比较，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞的凋亡率明显减少（P＜0.05）。见图1。

图1 五组食管癌Eca109细胞凋亡率的比较

2.2 紫草素对Eca109细胞中凋亡基因表达的影响对照组、0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0μmol∕L紫草素组及2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞中cleaved caspase-3的表达水平分别为0.41±0.07、0.64±0.14、0.81±0.19、1.02±0.24、0.34±0.08。经统计学分析，与对照组比较，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0μmol∕L紫草素 组Eca109细胞中cleaved caspase-3的表达明显增加（F=11.31，P＜0.001）且随着紫草素剂量增加，细胞中cleaved caspase-3的表达量相应增加；与2.0 μmol∕L紫草素组比较，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞中cleaved caspase-3的表达明显减少（t=6.01，P＜0.001）。见图2。

图2 五组食管癌Eca109细胞中cleaved caspase-3的蛋白条带

2.3 紫草素对Eca109细胞周期的影响与对照组比较，0.5 μmol∕L紫草素组、1.0 μmol∕L紫草素组、2.0 μmol∕L紫草素组Eca109细胞G1期比例明显增加，S期比例明显减少（P＜0.05）且随着紫草素剂量增加，细胞G1期比例相应增加，S期比例相应减少；与2.0 μmol∕L紫草素组比较，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞G1期比例明显减少、G2期比例明显增加（P＜0.05），S期比例无明显变化（P＞0.05）。见表1。

表1 五组食管癌Eca109细胞G1期、S期、G2期的比较

表1 五组食管癌Eca109细胞G1期、S期、G2期的比较

注：IGF-1为胰岛素样生长因子-1。①与对照组比较，P＜0.05。②与0.5 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。③与1.0 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。④与2.0 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。

组别对照组0.5 μmol∕L紫草素组1.0 μmol∕L紫草素组2.0 μmol∕L紫草素组2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组F值P值重复次数5 5 5 5 5 G1期24.85±6.58 33.22±7.79①45.41±9.28①②59.39±9.83①②③30.72±8.37④13.29＜0.001 S期63.32±10.93 56.75±8.28①45.47±9.14①②31.75±7.75①②③60.27±12.38④8.64 0.001 G2期11.83±2.84 10.02±1.77 9.12±1.85①8.86±1.34①9.01±1.27 2.13 0.128

2.4 紫草素对Eca109细胞中细胞周期蛋白表达的影响对照组、0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草 素 组 及2.0 μmol∕L紫 草 素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞中cyclin D1的表达水平分别为0.91±0.18、0.80±0.16、0.68±0.13、0.45±0.09、1.02±0.20。经统计学分析，与对照组比较，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素组Eca109细胞中cyclin D1的表达量明显减少（F=9.37，P=0.001）且随着紫草素剂量增加，细胞中cyclin D1的表达量相应减少；与2.0 μmol∕L紫草素组比较，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞中cyclin D1的表达量明显增加（t=5.81，P＜0.001）。见图3。

图3 五组食管癌Eca109细胞中cyclin D1的蛋白条带

2.5 紫草素对Eca109细胞中PI3K/AKT通路的影响与对照组比较，0.5 μmol∕L、1.0 μmol∕L、2.0 μmol∕L紫草素组Eca109细胞中p-PI3K、p-AKT的表达量明显减少（P＜0.05）且随着紫草素剂量增加，细胞中p-PI3K、p-AKT的表达量相应减少；与2.0 μmol∕L紫草素组比较，2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组Eca109细胞中p-PI3K、p-AKT的表达量明显增加（P＜0.05）。见图4，表2。

图4 五组食管癌Eca109细胞中p-PI3K、p-AKT的蛋白条带

表2 五组食管癌Eca109细胞中p-PI3K、p-AKT表达量的比较

表2 五组食管癌Eca109细胞中p-PI3K、p-AKT表达量的比较

注：p-PI3K为磷酸化PI3K，p-AKT为磷酸化AKT。①与对照组比较，P＜0.05。②与0.5 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。③与1.0 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。④与2.0 μmol∕L紫草素组比较，P＜0.05。

组别对照组0.5 μmol∕L紫草素组1.0 μmol∕L紫草素组2.0 μmol∕L紫草素组2.0 μmol∕L紫草素+10 μg∕L IGF-1组F值P值重复次数5 5 5 5 5 p-PI3K 0.92±0.19 0.81±0.14①0.44±0.08①②0.20±0.07①②③1.19±0.25④25.67＜0.001 p-AKT 0.87±0.20 0.75±0.14①0.40±0.08①②0.23±0.05①②③1.05±0.23④23.52＜0.001

3 讨论

紫草素的抗癌作用与其促进癌细胞凋亡及细胞周期阻滞有关，本实验将紫草素用于食管癌Eca109细胞的干预，旨在发挥其抗癌作用。细胞凋亡及细胞周期的异常与食管癌的发生密切相关，在使用不同剂量紫草素处理食管癌Eca109细胞后，细胞凋亡率及细胞周期G1期的比例明显增加，细胞周期S期和G2期的比例明显减少，说明紫草素能够促进食管癌Eca109细胞发生凋亡，同时使细胞周期大量停滞于G1期、不进入S期及G2期，这与紫草素在其他恶性肿瘤细胞中促进细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用一致，也表明紫草素具有抗食管癌的作用。

Huang、Hu［6］在子宫内膜癌及Guo等［7］在肺癌中的研究证实，紫草素通过调节B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）及Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）的表达来促进细胞的线粒体途径凋亡。Bcl-2和Bax是调节线粒体途径凋亡的关键基因，前者抑制线粒体内细胞色素C向细胞质的释放，后者则促进线粒体内细胞色素C向细胞质的释放；细胞色素C进入细胞质后，能够启动一系列级联放大反应并使有活性的cleaved caspase-3增多，最终增强细胞凋亡。在食管癌的发病过程中，bcl-2的表达增多、Bax的表达减少，癌细胞的线粒体途径凋亡受到抑制，进而造成了细胞增殖活力的增强［8-9］。在本研究中，不同剂量紫草素处理食管癌Eca109细胞后，cleaved caspase-3的表达明显增加，与紫草素增加Eca109细胞凋亡率的作用吻合，进一步确认了紫草素用于食管癌细胞干预的促凋亡作用。

在肺癌及膀胱癌中的研究证实，紫草素能够抑制cyclin D1的表达，进而使细胞周期发生停滞［10-12］。CyclinD1是调控细胞周期的关键蛋白，与相应的激酶CDK4、CDK6形成复合物后时细胞快速通过细胞周期检查点并大量进入有丝分裂期。在食管癌组织中，cyclin D1的表达明显增多、加速细胞周期的作用增强，有利于癌细胞的有丝分裂［13-14］。在本研究中，不同剂量紫草素处理食管癌Eca109细胞后，cyclin D1的表达明显减少，与紫草素增加Eca109细胞G1期比例的作用吻合，进一步确认了紫草素用于食管癌细胞干预的细胞周期阻滞作用。

食管癌细胞的恶性生物学行为受到复杂机制的调控，其中PI3K∕AKT通路在细胞凋亡及细胞周期的调控中起关键作用，该通路的激活对线粒体凋亡基因及细胞周期蛋白的表达均有调控作用［15-16］。在胃癌、肺癌、白血病细胞中，紫草素均对PI3K∕AKT通路的激活具有抑制作用［3，17-18］。本研究在使用不同剂量紫草素处理食管癌Eca109细胞后，细胞中p-PI3K、p-AKT的表达明显减少，表明紫草素能够抑制食管癌细胞中PI3K∕AKT通路的激活，这也可能是紫草素促进食管癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的可能机制。为了验证这一机制，PI3K∕AKT通路的激动剂IGF-1被用于细胞处理，紫草素与IGF-1联合使用后，紫草素促进细胞凋亡及细胞周期阻滞、调节凋亡基因及细胞周期蛋白表达的作用均发生了逆转，表明紫草素促进食管癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用与抑制PI3K∕AKT通路的激活有关。

综上所述，紫草素具有促进食管癌细胞凋亡及细胞周期阻滞的作用，该作用与抑制PI3K∕AKT通路激活有关，今后紫草素有望成为治疗食管癌的辅助药物，但仍需更多的在体实验进行验证。