张金磊，邢丽杰，罗瑞峰，张 飞，陈永发，巩婧婷，贺玉凤

（新疆农垦科学院分析测试中心，新疆石河子 832000）

0 引言

随着人们生活水平的提高，鸡蛋作为日常膳食中蛋白质主要来源，越来越有着不可替代的作用[1]。甲硝唑是人工合成硝基咪唑类药物，对家禽的滴虫病感染、肠道的厌氧菌感染、生殖系统疾病等有着很好的疗效[2-3]。因而常作为驱虫药添加在饲料中，并且可用于改善饲料转化率。如果养殖过程中用药不规范，没有遵守休药期，甲硝唑加入饲料中，容易造成动物源性食品中甲硝唑的残留[4]。然而甲硝唑对人体有多种毒副作用，尤其具有潜在致癌性和致遗传变异作用[5-6]，且甲硝唑进入人体后能快速分布于全身，因此对鸡蛋中甲硝唑的残留检验非常必要。

欧盟在1998 年规定甲硝唑在食品动物体中不得检出，在2019 年，我国发布的GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，甲硝唑药物允许作为治疗动物疾病使用，并且在动物源性食品中不得检出[7]。目前，甲硝唑残留检测的方法主要包括液相色谱法[8]、液相色谱串联质谱法[9-11]等。但是针对动物肌肉组织中的甲硝唑残留检测方法研究较多，鸡蛋液体基质比肌肉固体组织复杂。现行国标方法对鸡蛋中甲硝唑残留检测分析较少[12]；同时，前处理方法复杂繁琐，不利于大批量检测。因此，通过对鸡蛋中甲硝唑的提取、净化及流动相组成等因素的优化，建立了高效液相色谱串联质谱快速检测鸡蛋中甲硝唑的方法，该方法灵敏度高、准确性好、快速、高效，适用于鸡蛋中甲硝唑残留的筛查和测定。

1 试验部分

1.1 试剂与材料

甲醇、乙腈、甲酸（HPLC 级），德国CNW 公司提供；甲硝唑（纯度大于99.0%），德国Dr.Ehrenstorfer 公司提供；超纯水；鸡蛋，购自当地不同超市、农贸市场和生产基地，去壳，经匀浆（10 000 r/min）后，置于-20 ℃下冷冻保存备用。

1.2 仪器设备

Agilent 1200+6460 型高效液相色谱串联质谱仪，美国Agilent 公司产品；MS3 basic 型漩涡混合器，德国IKA 公司产品；Sigma 3-30k 型高速冷冻离心机，德国Sigma 公司产品；KQ-600DE 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；IQ7000 型超纯水仪，美国Milli-Q 公司产品。

1.3 UPLC-MS/MS 检测条件

色谱条件：ZORBAX SB-Aq Solvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱，色谱柱温度30 ℃，流动相组成：水-甲醇（梯度），进样量5 μL，流速0.6 mL/min，梯度洗脱。

以水-甲醇为流动相的梯度洗脱程序见表1。

表1 以水-甲醇为流动相的梯度洗脱程序

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；质谱扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压4 000 V，干燥气温度325 ℃，干燥气流速10 L/min，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min。

甲硝唑的质谱参数见表2。

表2 甲硝唑的质谱参数

1.4 样品前处理

称取经匀浆后的鸡蛋2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入0.2%甲酸乙腈溶液10 mL，涡旋振荡混匀1 min，30 ℃下恒温超声提取30 min；以转速10 000 r/min 离心5 min，取上清液5 mL 直接加入到PRiME HLB 固相萃取小柱上，无需活化，控制流速在3～4 mL/min，收集全部流出液。于40 ℃下氮吹至近干，用0.1%甲酸水+甲醇（90+10）溶液定容至2 mL，涡旋混匀后过0.22 μm 有机微孔滤膜，供HPLC-MS/MS 法测定。

1.5 标准溶液的配制

准确称取甲硝唑标准品25 mg，用甲醇溶于25 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1.0 mg/mL 的标准储备溶液，置于-20 ℃下避光保存。准确移取0.025 mL标准储备液至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配置成1 μg/mL 的标准中间溶液，用基质空白溶液将中间液逐级稀释，配制成2，4，10，20，30，40 ng/mL的甲硝唑系列工作溶液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，供高效液相串联质谱仪检测。

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

在电喷雾电离和多反应监测模式下，对100 ng/mL甲硝唑标准溶液多次注射进样，通过对鞘气温度、鞘气流速，毛细管电压、碰撞电压、碰撞能量等质谱参数进行优化。选择稳定性好、丰度高和干扰小的2 个碎片离子作为甲硝唑定量离子和定性离子，并以丰度最强、响应值最高的离子对作为定量离子对。

甲硝唑的MRM 离子对质谱图见图1。

图1 甲硝唑的MRM 离子对质谱图

2.1.2 色谱条件的优化

通过比较水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇4 种流动相体系对甲硝唑响应值的影响。结果发现，当流动相为水-甲醇体系，甲硝唑的响应较高。因此，选用水-甲醇体系作为检测鸡蛋中甲硝唑的流动相。

不同流动相体系对甲硝唑提取效率的影响见图2。

图2 不同流动相体系对甲硝唑提取效率的影响

2.2 提取条件的选择与优化

甲硝唑属于硝基咪唑类药物，微溶于乙醇和水，在乙酸乙酯和乙腈中有较好的溶解性。鸡蛋中有蛋白质、脂肪、水、磷脂等物质，由于乙酸乙酯和乙腈都可以较好地提取鸡蛋中的甲硝唑，但是乙酸乙酯提取的杂质较多，且对仪器干扰较大。而乙腈作为提取溶剂，可以起到沉淀蛋白质的作用，可通过离心去除。但是大量的脂肪和磷脂类会和目标物一起提取出来，这些物质会干扰LC-MS 分析，污染液相系统。所以，试验选择用PRiME HLB 小柱对提取液进行净化，PRiME HLB 小柱可有效去除提取液中大部分脂肪和磷脂类物质，从而达到净化除杂的目的。

3 方法学评价

3.1 线性关系和检出限

取6 份空白样品，样品经过前处理得到空白基质，取一定量的甲硝唑标准中间液，用空白基质稀释成适当的浓度，配制成标准系列工作曲线。在优化后的前处理和仪器条件下，对一系列空白基质中添加的甲硝唑标准工作溶液进行测定，以定量离子峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标进行回归分析。结果表明，甲硝唑在2～40 ng/mL 范围内呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.999 6。信噪比S/N 为3 时，计算甲硝唑的检出限为0.5 μg/kg，信噪比S/N为10 时，计算甲硝唑的定量限为1 μg/kg。该方法线性关系良好、灵敏度高。

甲硝唑的线性方程、线性范围、相关系数见表3。

表3 甲硝唑的线性方程、线性范围、相关系数

3.2 回收率和精密度

选取空白鸡蛋样品，按照试验方法进行3 个质量浓度水平添加回收率试验，每个水平重复测定6 次。

甲硝唑的回收率和精密度见表4。

表4 甲硝唑的回收率和精密度

鸡蛋中甲硝唑的平均回收率为83.2%～104.0%，相对标准偏差为0.8%～1.2%。说明该方法回收率和精密度良好。

鸡蛋空白样品添加质量浓度为5 ng/mL 的基质标见图3，鸡蛋空白样品LC-MS/MS 谱图见图4，鸡蛋样品中添加量为4 μg/kg 的LC-MS/MS 谱图见图5。

图3 鸡蛋空白样品添加质量浓度为5 ng/mL 的基质标

图4 鸡蛋空白样品LC-MS/MS 谱图

图5 鸡蛋样品中添加量为4 μg/kg 的LC-MS/MS 谱图

4 与标准比较

在SN/T 2624—2010《动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱质谱/质谱法》标准方法中样品提取净化方法繁琐、复杂，且步骤繁多。需要用到的试剂很多，并且提取试剂用量较大，净化过程繁杂，需要多次转移提取液，试验的可操作性差、重现性较低、试验耗时较长，不适用于大批量检测。试验试剂用量较少，固相萃取柱无需活化，大大提高了前处理速度，提高了检测效率，适用于大批量的筛查和测定。

5 结论

采用ZORBAX SB-Aq 型色谱柱分离，优化了液相、质谱、提取及净化等条件，提高了鸡蛋中甲硝唑的提取和净化效率，方法学验证测定结果良好。表明该方法灵敏度高、准确性好，且高效、快速操作简单，适于鸡蛋中甲硝唑的快速筛查和测定。