于臻 王凯 徐家淳 孙伟明 张琳琳

(1天津市中医药研究院附属医院，天津 300120；2天津中医药大学；3天津中医药大学第二附属医院)

阿尔茨海默病(AD)是最常见的与年龄相关的神经退行性疾病，以进行性记忆减退为主要临床症状，是痴呆的最常见类型〔1〕。AD病理上主要表现为β淀粉样蛋白(Aβ)过度沉积形成老年斑、tau蛋白异常磷酸化形成神经元纤维缠结和进行性的神经元突触缺失〔2〕，其中Aβ在脑内异常增多聚集产生神经毒性是AD的始动与中心环节〔3〕，并可增强tau病理变化〔4〕，诱导细胞凋亡、氧化应激、炎症反应、葡萄糖及能量代谢障碍等一系列病理过程〔5〕，造成突触功能障碍、神经元丢失导致AD认知障碍〔6〕，且这一病理改变在AD临床症状出现前15～20年就已开始〔7〕。因此，减少Aβ生成和聚集，进而减轻Aβ的神经毒性作用是AD防治的重要方面。AD属祖国医学“痴呆”“健忘”等病症范畴〔8〕，中医药方法多样，具有多途径、多靶点的独特优势，已得到越来越多的关注。针对AD至今尚无有效的防治手段，本文将Aβ生成、聚集机制及近年来中药靶向于此的相关实验研究进展进行综述。

1 Aβ生成

Aβ来源于神经元中淀粉样前体蛋白(APP)，由APP基因编码产生，广泛存在于全身组织细胞的一种跨膜蛋白，包括一段较长的细胞外N端和一段较短的细胞内C端，主要有2种代谢方式〔9〕：①非淀粉样代谢途径，新生的APP通过反式高尔基体网络(TGN)进入细胞表面，首先经其上α-分泌酶剪切形成可溶性的N端片段(sAPPα)分泌到细胞外，sAPPα具有神经保护作用〔10〕；细胞内的C端片段(αCTF)经过γ-分泌酶分解成可溶性的短肽链和APP蛋白细胞片段。②淀粉样代谢途径：APP首先经β-分泌酶(BACE)1剪切形成可溶性的N端片段(sAPPβ)分泌到细胞外；细胞内C端片段(βCTF)经γ-分泌酶剪切后可生成大量含有36～43个氨基酸残基的Aβ单体，分子量为4 kD左右，人体内约90%为含有40个氨基酸的Aβ40，其次是比Aβ40在C端多出2个氨基酸的Aβ42片段〔11〕。这2种代谢方式是相互竞争的〔12〕，因此增加α-分泌酶的表达可相应的减少APP进入淀粉样代谢途径生成Aβ。而γ-分泌酶由早老素(PS)1和2基因参与编码产生，主要包括4个亚基，水解底物众多，故抑制γ-分泌酶的药物常因影响Notch等重要信号通路的正常生理功能而产生多种严重的不良反应〔13〕。BACE1在脑内神经元中高表达，研究显示〔14〕，在散发型AD和AD源性轻度认知功能障碍(MCI)患者的大脑或脑脊液中BACE1的表达或活性明显高于正常对照，所以常通过抑制BACE1的表达活性减少Aβ的生成〔15〕。

在淀粉样代谢途径中，APP经内吞作用进入胞质内，形成内体，在内体中被BACE1和γ-分泌酶连续切割产生Aβ单体，随后可通过胞吐释放到细胞外。其中Vps10p家族中分拣蛋白相关受体1(SorLA)作为APP的分选受体，可介导其与逆向转运体Retromer复合物结合由内体逆向转运至TGN中，并延长其在TGN内的停留时间〔9〕，使APP重新回到细胞膜上参与非淀粉样代谢，以降低APP进入淀粉样代谢途径的概率〔16〕。同时SorLA还可直接引导新生成的Aβ进入溶酶体中降解〔17〕，从而减少Aβ的释放和沉积。由上可见，Aβ的生成与APP及α、β、γ各分泌酶均密切相关，促进APP的逆转运，抑制其被水解为Aβ单体，也是减少Aβ生成的关键环节。

2 Aβ聚集

APP剪切后形成的Aβ单体并不具有毒性〔18〕，Aβ聚集后方产生神经毒性。Aβ因其自身结构的原因，经过翻译后修饰很容易自聚集形成寡聚体、原纤维至成熟稳定的纤维聚集体，使Aβ的结构由α螺旋向β折叠转换，并最终在神经元外沉积形成老年斑(SPs)〔19〕。Aβ蛋白主要分为亲水性较强的N端区域和疏水性较强的C端区域两部分，是一种典型的两亲性多肽，其中C端中的序列Lys16-Phe20是聚集的核心区域，也是聚集体中β-sheet结构的主要组成部分〔20〕，而N端基本不参与该结构的形成〔21〕，Aβ42因在C端多出几个氨基酸使其更易于聚集，不仅聚集的速度更快，其聚集体的毒性也更强〔22〕。翻译剪切后的Aβ蛋白，在特定条件下会进行翻译后修饰，对Aβ的错误聚集产生一定影响，如磷酸化和焦谷氨酸化修饰都会增强Aβ聚集成寡聚体和纤维体〔23〕，并与AD的病程发展具有一定的相关性〔24〕，或可成为AD发病过程中不同时期的诊断标志物〔25〕。

Aβ的聚集过程非常复杂，受多种因素影响〔26〕，聚集动力学上将这个过程常描述为一个典型的S形曲线，认为Aβ呈“成核生长”机制，Aβ单体先经过一定的构象转化聚集形成寡聚体、原纤维，并逐渐形成“聚集核”，此时为延滞期；当聚集达到一定程度后进入伸长期，在“聚集核”的催化下，快速聚集生长，形成成熟的纤维聚集体，达到稳定平台期。其中，可溶性的Aβ寡聚体神经毒性最强〔27〕，因其与细胞膜有很强的相互作用，并能和多种受体结合，比SPs沉积更与认知能力变化具有相关性，被认为是造成AD病理的可能“元凶”〔28〕，包括二聚体、三聚体、Aβ56(56 kD)、Aβ来源可溶性配体(35～60 kD)、球聚体(38～48 kD)及环状原纤维 (APFs)〔29〕。

3 中药对AD中Aβ生成和聚集的调控作用

3.1减少Aβ生成 针对上述Aβ生成过程中的各关键靶点，中药复方益肾化浊方在快速老化小鼠(SAMP8)和AD模型大鼠上进行干预，发现其可通过下调APP、PS1基因的表达〔30〕，上调α-分泌酶和sAPPα的表达水平〔31〕，进而减少海马区Aβ含量〔32〕，保护海马神经元和突触，从而在行为学上显著改善模型鼠的学习记忆能力〔33〕。古代名方地黄引子〔34〕正符合AD肾精亏虚为本痰瘀阻窍为标的病机特点，故可用于AD的防治中，其对于Aβ生成也具有一定的干预作用，采用免疫组化法探索其作用机制发现该复方通过显著下调β-APP和BACE1，减少淀粉样代谢途径，实现显著降低AD模型大鼠脑内Aβ的表达水平。湖北中医药大学团队〔35〕依据AD本虚标实的特点，由“五补丸”(《太平惠民和剂局方》)化裁创制固本健脑液，用党参、枸杞子分别顾护先后天之本，酸枣仁、茯苓合山楂以奏健脑之效，从APP加工及转运过程探讨其对Aβ生成的影响，发现该方可通过上调AD模型大鼠SorLA mRNA和蛋白及逆转运复合体的表达，降低海马中Aβ42的水平，进而改善AD模型的学习记忆能力。养血清脑方〔36〕由黄连解毒汤加减化裁而来，内含黄连、黄芩、黄柏、丹参、延胡索、钩藤6种中草药，可通过降低3XTg-AD 和5XFAD两种转基因小鼠的APP及其C端片段的表达，降低Aβ的生成及负荷，显著改善两种小鼠的记忆和认知功能。北京宣武医院团队运用慢性脑低灌注的体内外模型研究远志汤及其有效成分远志皂苷元和β-细辛脑〔37〕治疗老年人认知功能障碍的具体机制，发现该方及活性成分在体外可通过降低APP分泌酶BACE1和PS1的表达水平，降低Aβ40和Aβ42的含量，提高神经元的存活率，进而降低体内大鼠模型中Aβ的聚集。

中药单体也可减少细胞和动物模型中Aβ的生成，如石菖蒲的主要成分之一β-细辛脑〔38〕在PC12细胞AD模型中可通过降低APP、PS1、BACE1蛋白的表达水平，抑制体外Aβ的表达；补肾中药女贞子的有效成分齐墩果酸〔39〕可显著下调SAMP8小鼠海马组织中APP、PS1基因的表达水平，抑制Aβ的形成，保护神经元形态；β-谷甾醇〔40〕具有神经保护作用，可通过降低APP/PS1双转基因小鼠脑中BACE1的表达减少Aβ生成，改善小鼠空间学习和识别记忆障碍，提示其可能在一定程度上预防AD；用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹直接检测羌活中的提取物羌活呋喃考马林〔41〕干预HEK-APPswe293T细胞后Aβ的水平，发现其呈剂量依赖性抑制Aβ的分泌和产生，体内实验也显示其能显著降低APP/PS1小鼠海马和皮层中Aβ的含量，改善AD模型的认知功能；同样，传统天然化合物枸杞多糖〔42〕也可降低APP/PS1转基因小鼠Aβ的水平，体外实验采用神经元细胞SK-N-SH和AD细胞模型HEK293/APPswe中进行验证，结果一致，提示其可显著减少Aβ的生成，且不影响细胞活力；丹参酮ⅡA磺酸钠〔43〕干预Aβ诱导的SH-SY5Y细胞，ELISA和Western印迹检测结果显示其可降低Aβ水平，ELISA和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)提示其可能通过提高α分泌酶活性及降低BACE1活性调控Aβ的产生，从而减轻Aβ对细胞的损伤，发挥神经保护作用。

3.2抑制Aβ聚集 中药复方养血清脑方〔44〕从Aβ自聚集及其介导的细胞毒性角度进行了系统研究，采用生物化学、生物物理和基于细胞的方法发现，该方明显减少了Aβ42的纤维形成，并改变其β-sheet构象，表明其可抑制淀粉样蛋白的一级成核作用，在Aβ损伤的SH-SY5Y细胞模型中，大剂量的养血清脑方可减弱约60%的Aβ诱导的细胞毒性，同时有效改善细胞畸形，从而通过Aβ42的毒性聚集发挥神经保护作用，显示出防治AD的潜力。韩国研究由薏苡仁、龙眼、桔梗、菖蒲、酸枣仁、五味子、远志等14味中草药共64 g组成的调胃升清汤复方〔45〕，通过体外硫黄素(Th)T实验和体内5XFAD小鼠模型4G8、ThS组织化学分析均表明该复方具有显著抗Aβ聚集的作用，补中益气汤体内研究也显示其可增强抑制Aβ聚集〔46〕。

但目前更多的是发现很多中药小分子可抑制Aβ聚集所引起的神经细胞毒性，并据此进行药物的设计合成与开发研制，其中以姜黄素〔47〕、白藜芦醇〔48〕、阿魏酸〔49〕等为代表的化学小分子抑制剂，主要针对Aβ自聚集过程中的特征结构β-片层的形成，从而有效调节其聚集。此外，还有以天然产物表儿茶素(EGCG)〔50〕和苏木中主要活性成分巴西木素〔51〕等为代表的化合物，可通过有效打散Aβ聚集体的方式缓解其聚集造成的神经毒性。采用ThT进行荧光光谱分析及原子力显微镜观察金银花中提取纯化的果胶多糖LFA03-a发现〔52〕，LFA03-a呈剂量依赖性抑制Aβ42的聚集并抑制其寡聚体和纤维的形成，同时LFA03-a可轻度诱导分化PC12细胞，促进神经纤维的生成，提示果胶LFA03-a可能是防治AD的一潜在靶向药物。另一些研究也利用体外ThT实验进行观察，如山楂的乙醇提取物〔53〕对Aβ聚集的影响发现，该提取物对Aβ纤维的形成呈浓度依赖性，并能引发纤维的分解，阻断Aβ诱导的神经元死亡；酸枣仁中主要活性成分黄酮类化合物斯皮诺素〔54〕不仅可抑制Aβ1-42的聚集，体外细胞实验也显示其可通过影响APP过程减少Aβ1-42的产生。灯盏生脉胶囊主要活性成分黄芩苷〔55〕体内干预APP/PS1小鼠发现其缓解该AD小鼠认知功能障碍的作用与黄芩苷上调其皮层低毒性的淀粉样斑块、下调高毒性的Aβ42和Aβ40水平有关，体外通过生化分析证实其可加速Aβ42单体转化为高分子量聚集体，并通过微量热泳法测定其与Aβ单体的结合，利用计算对接模型预测了其与Aβ纤维的结合区域，提示其在AD防治中具有潜在临床应用价值。

综上，中药减少Aβ生成机制的体内外实验多围绕调控APP及其代谢过程中的3个分泌酶的相关表达进行，并采用ELISA、Western印迹、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光等方法予以检测，以期从根源上降低Aβ产生、预防AD；而中药抑制Aβ聚集的研究较复杂，多是在体外进行观测，因涉及蛋白构象等转变，常采用ThT动力学、圆二色谱、原子力显微镜或透射电镜、固态核磁等技术手段进行，且多以中药单体研究为主，关注环节相对单一。Aβ的生成和聚集所致神经毒性并不是孤立存在，两者呈链式级联反应紧密相连，而中药的多靶点特性常使其作用于多个环节发挥效力。因此，研究中药复方在Aβ生成与聚集过程中的调控作用，对于阐释中药复方作用机制及防治AD均具有重要意义。