王笑冉郑 攀

(河南中医药大学基础医学院,郑州 450046)

发作性睡病一词,由Gelineau 于1880 年首次提出,本病是一种原因不明的中枢性睡眠障碍,以白天不可抗拒的短期嗜睡发作和异常的快速动眼睡眠(猝倒、睡眠幻觉和睡眠瘫痪)为典型特征,多于儿童或青年期起病[1]。 由于对此病缺乏认识,常出现漏诊而延误治疗,严重影响患者的工作学习生活,甚至造成意外事故危及生命。 选择合适的动物模型用于研究该病发病机制,发掘潜在的治疗靶点显得尤为重要。 本文对目前已有的发作性睡病模型进行综述,总结其诱发机制、模型应用的优缺点等,以便研究者可以据此选择更贴合实验目的的造模方法,获得更准确的研究结果。

1 自发性动物模型

自发性动物模型指实验动物未经任何人工干预,在自然状态下发生的、或由基因突变的异常表现通过遗传育种保留下来的动物疾病模型[2]。 目前,已证实的NRL 自发性模型为犬类动物模型。 早在上世纪八十年代,人们在犬身上发现与人类发作性睡病极为相似的症状[3-4]。 1999 年,Lin 等[5]揭示了犬发作性睡病是由于食欲素受体2(orexin receptor 2, OX2R)的基因突变。 家族性发作性睡病呈常染色体隐性遗传存在于杜宾犬和拉布拉多猎犬的品系中,由OX2R 基因的外显子跳跃突变引起,而散发性犬发作性睡病与脑脊液中食欲素多肽显著降低有关。 其表现为突然的肌张力丧失和快速动眼睡眠(rapid eye movement sleep, REM)发作,首次出现在青春期前,成年后症状相对减轻[6-7]。 自此各种基于下丘脑泌素/食欲素系统(hypocretin,Hcrt)的动物模型根据不同的研究目的被建立。

2 基因工程模型

2.1 基因敲除模型

2.1.1 Hcrt/Orexin 基因敲除小鼠

食欲素(orexin),又称下丘脑泌素,是下丘脑外侧区食欲素能神经元合成和分泌的小分子神经多肽(Hcrt-1、Hcrt-2 或称Orexin-A、Orexin-B),其来源于同一种前体多肽并通过蛋白水解产生[8-9]。 人类食欲素原基因(prepro-orexin)由两个外显子和一个内含子组成,通过克隆prepro-orexin-nlacZ融合基因替换小鼠prepro-orexin基因的第一个外显子获得重组基因并导入C57BL/6J 小鼠胚胎干细胞,借助杂交建立纯合子Orexin 基因敲除小鼠。 经免疫组化、原位杂交及放射免疫分析方法均证实,该小鼠Hcrt神经阳性表达丧失,出现与人类NRL 相似的嗜睡、睡眠周期缩短及次数增加等症状。 表现为REM 潜伏期缩短,觉醒时间略有减少,觉醒-REM 转换加快,但有正常的非快速动眼睡眠(non-rapid eye movements, NREM )[10-11]。 Mochizuki 等[12]对Orexin 基因敲除小鼠进行深入研究,证实其具有正常睡眠-觉醒行为的昼夜节律控制,且受Orexin 高度刺激的促觉醒单胺类神经递质如去甲肾上腺素和组胺等未见异常。 Orexin 基因敲除小鼠证明了Hcrt 神经元是内源性睡眠/觉醒调节系统的重要组成部分,但代偿表达增强的下丘脑外侧黑色素浓缩激素神经元仍可调节睡眠-觉醒回路,明显干扰了研究对Orexin 基因本身表达产生嗜睡的解释[13-15]。2.1.2 OX2R/OX1R 基因敲除小鼠

Orexin 通过与G 蛋白偶联受体(OX1R 和OX2R)结合,参与调节多种生理反应。 在大脑皮层,OX1R 和OX2R 的mRNA 表达有明显的昼夜节律[16-17]。 Willie 等[18]通过线性化载体的同源重组,在胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)中用β 半乳糖苷酶(LacZ)和新霉素抗性(NEO)表达盒替换OX2R 基因第一个外显子。 正确定向的ES 细胞克隆被分离并注射到C57BL/6J 囊胚中。 纯合型小鼠无法检测OX2R mRNA 表达,在睡眠结构上表现出轻度的REM 睡眠增加和猝倒发作,并出现清醒状态下的NREM 睡眠侵入。 Kalogiannis 等[19]基于纯合单受体基因敲除杂合子OX2R/OX1R 构建双重Orexin 受体基因敲除小鼠,表现出了较OX2R 基因敲除小鼠更强烈的发作性睡病表型,特征为频繁发作的觉醒-睡眠转换;REM 睡眠潜伏期缩短,时间延长;觉醒时间显著减少并出现猝倒发作,其与Orexin基因敲除小鼠行为学相似。 对Hcrt 受体的遗传操作是构建发作性睡病模型的另一种方法。

2.2 转基因模型

2.2.1 Orexin/Ataxin-3 转基因小鼠

Ataxin-3 是脊髓小脑性共济失调3 型的疾病蛋白,多选用SD 大鼠或Wistar 小鼠建模。 Beuckmann研究小组首次构建Orexin/Ataxin-3 mice,通过在prepro-orexin启动子后连接一段在N 端表达含有多聚谷氨酸片断的ataxin-3 蛋白,在C 端连接用于组织学检查的Myc癌基因序列,对尾部活检组织的基因组DNA 进行PCR 扩增并注射到Wistar 小鼠受精卵原核中,产成Orexin/Ataxin-3 转基因系[20-21]。 由于Hcrt 启动子驱动的细胞毒基因产物PolyQ-ataxin-33 积累,Hcrt 神经元逐渐选择性地丢失。 17 周龄,用Myc 标记免疫组织化学染色法检测显示转基因小鼠下丘脑外侧区出现Hcrt 阳性神经元丧失,在乳头核、中央灰质、穹隆周围核、弓状核等同样缺乏Hcrt 投射。 在睡眠结构上,模型小鼠表现出亮期REM 潜伏期缩短,暗期觉醒时间减少、REM 睡眠时间延长,觉醒-REM 转换加快,但在24 h 的清醒和NREM 睡眠时间保持不变。 此模型中Hcrt 神经元消融是渐进性的,减轻了结构性食欲素原基因敲除的代偿作用,更能代表人类发作性睡病的病理改变。2.2.2 OX2R 转录干扰小鼠

OX2R 对Orexin-A 和Orexin-B 表现出同等的亲和力,在大脑皮层、隔核、海马、丘脑内侧核、中缝核和许多下丘脑核(包括组胺能结节乳头核)中的表达显著[22-23]。 基于Cre-loxP 重组[24],采用了转录干扰策略在EL250 细菌细胞中构建靶向载体,使用loxP 侧翼的基因盒来干扰OX2R 的产生,利用下丘脑结节乳头核(tuberomammillary nucleus, TMN)神经元orexin-A 细胞电生理反应的缺失验证该菌株中OX2R 信号的缺失。 进一步将编码Cre 重组酶的腺相关病毒载体(AAV-Cre)注射到C57BL/6J 小鼠双侧颞下颌核区,以确定局部恢复OX2R 表达;并通过OX2R 转录干扰小鼠与雌性胚系中表达Cre 重组酶的Zp3-Cre 小鼠(jackson laboratory)杂交,完全恢复OX2R 信号[25]。 模型小鼠维持清醒的能力降低,表现为嗜睡和睡眠碎片化;与Orexin 敲除小鼠不同,OX2R 转录干扰小鼠只有罕见的猝倒发作。 用AAV-Cre 局部恢复TMN 神经元和邻近下丘脑后部的OX2R 后嗜睡症状有所减轻,但仍存在睡眠破碎。该模型制备过程是可逆的,可作为自身观察对照,为NRL 的靶向治疗提供思路,且为开发食欲素受体拮抗剂用于失眠的治疗提供了科学依据。

2.2.3 O/E3 转录因子缺失小鼠

O/E3 属于碱性螺旋-环状转录因子家族,通过控制必需的下丘脑神经递质的表达及下丘脑神经纤维的正常发育,在功能性Hcrt 能回路的建立过程中起着核心作用[26]。 研究发现O/E3 在NRL 和Hcrt 能群体退化的模型中表达下调[27]。 De La Herrán-Arita 等[28]使用pRVKI 载体来构建O/E3 靶向构建体,并用可选择标记PGK-neo 取代O/E3 基因的前5 个外显子。 克隆一个3.2 kb 的O/E3 启动子区域的Xho IBamH I 片段,作为单纯疱疹病毒酪氨酸激酶与pRVKI 的PGK-neo 选择标记之间的5’同源臂。 从O/E3 基因下游至第5 外显子的5.3 kb的Spe I-Sal I 片段被克隆为pRVKI 载体pGK-neo 选择标记下游的3’同源臂。 再将PCR 和Southern 杂交检测呈阳性,并携带正确的靶向插入的ES 细胞注射到C57BL/6NCr1 小鼠囊胚中,获得O/E3 缺失的纯合子小鼠。 其表现出REM、NREM 睡眠时间延长,REM 潜伏期缩短,暗期觉醒时间减少,出现睡眠幻觉及厌食症状。 免疫组化染色发现,O/E3 缺失导致下丘脑Hcrt 细胞数量显著减少,局限于后部及穹隆周围区域。 脑桥食欲素能神经支配受损,通过静脉注射Hcrt-1 可逆转发作性睡病表型[29]。 此模型突出了转录因子在控制睡眠-觉醒周期的神经亚群调节中的重要性,为理解复杂的食欲素神经元电路开辟了新的选择。

3 化学诱导动物模型

3.1 白喉毒素A(diphtheria toxin chain A, DTA)诱导模型

白喉毒素是一种具有高度免疫原性的蛋白质,可导致生物神经脱髓鞘。 基于Tet-off 调控系统控制转基因表达的技术,将白喉毒素受体基因特定表达于小鼠Hcrt 启动子上,构建Teto DTA 小鼠。 用哺乳动物四环素控制的转录激活因子(tetracyclinecontrolled transactivator, TTA)片段取代Hcrt/nLacZ转基因构建体的nLacZ基因,并注射到Teto DTA 小鼠受精卵(C57BL/6 小鼠)的原核中,通过C57BL/6J 小鼠培育出稳定的Hcrt-TTA 转基因品系[30]。Hcrt 神经元变性由四环素反式激活因子Tet-off(Teto) 系统控制的,膳食多西环素(doxcycline,DOX)与TTA 结合,通过Tet-off 调节蛋白阻止DTA的合成。 由于TTA 被连接到Hcrt 启动子上,从饮食中去除DOX 会启动DTA 的合成,仅在Hcrt 神经元中产生神经毒性[31-32]。 配对的Hcrt-TTA 小鼠和Teto DTA 小鼠进行交配产生Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠,将10% DOX 粉添加入正常饲料,在产前和出生后12 周内使用含DOX 饲料喂养,后换成普通饲料喂养至14 周,再重复用DOX 饲料喂养至25 周。 在睡眠结构上,在去除DOX 饮食后14 d,Hcrt-TTA/Teto DTA 小鼠出现频繁猝倒发作,主要发生在暗期及亮期的觉醒前期;REM 潜伏期缩短、睡眠时间延长;睡眠-觉醒转换次数增加。 行为学上,表现为进食量无改变,但运动减少,体重增加。 DAT 诱导模型可通过比较同一个体动物在Hcrt 神经元消融之前、期间和之后的行为和生理学,来研究Hcrt 神经元消融过程中NRL 的症状进展;且Hcrt 神经退行性病变在青春期前后诱导,更符合人类NRL 的发病进程。 模型小鼠体重增加,但食物摄入未改变,这与人类NRL 代谢表现类似。 实验者可自行控制Hcrt 神经元消融时间和持续时间,可用于猝倒的药理学研究,在Hcrt 神经输入受限时的网络重组研究。

3.2 核糖体失活蛋白(saporin, SAP)诱导模型

将内源性配体Hcrt2 与SAP 偶联,构建Hcrt2-sAP 神经毒素。 研究证实Hcrt2-sAP 可与含有HcrtR2 受体特异性结合,向大鼠下丘脑外侧核注射Hcrt2-sAP 可破坏Hcrt 神经元,从而减少脑脊液中Hcrt 含量,诱导大鼠的发作性睡病行为[33]。 Blanco-Centurion 等[34]利用Hcrt2-sAP,将其分别注入大鼠下丘脑外侧和腹侧0.5 mm 处,当Hcrt2-sAP 应用于下丘脑外侧时,受损大鼠出现NRL 表型;而损伤内侧隔区Hcrt 受体神经元并未观察到NRL 症状。 嗜睡大鼠表现出REM/NREM 睡眠时间延长;肌张力增加且出现广泛的肢体运动。 Arias-Carrión 等[35]对此模型大鼠进一步研究发现,当73% Hcrt 受体神经元被成功损毁时,脑脊液中Hcrt 水平降低50%。 并利用睡眠剥夺法检测下丘脑增食欲素表达,来测试睡眠调节的动态平衡机制,结果显示在损伤后6 h,增食欲素水平未见增加。 Hcrt2-sAP 诱导模型可通过靶向损伤受体神经元,阐明特定的Hcrt 神经支配在睡眠-觉醒行为中的作用,为探索移植作为NRL的治疗手段提供了思路。 但由于Hcrt2-sAP 可消融其他表达食欲素受体的LH 细胞群体,包括黑色素浓缩激素神经元和含腺苷脱氨酶的神经元等[36-37],所以此类模型与人类NRL 的发病机制存在差异。

3.3 硝基还原酶-甲硝唑诱导的斑马鱼模型

Hcrt 能神经元在斑马鱼中表现出调节睡眠和清醒行为的双重功能[38]。 Elbaz 等[39]将大肠杆菌的硝基还原酶B(nitroreductase B, nfsB)转基因特异性表达于Hcrt 能神经元中,构建了时空可控的Hcrt能神经元消融的转基因斑马鱼模型。 硝基还原酶通过将无害的前体药物甲硝唑(metronidazole,MET)转变为具有毒性的产物,对Hcrt 神经元进行消融[40-41]。 模型表现出白天REM 睡眠时间延长,睡眠-觉醒转换次数增加,对外部刺激反应性降低。由于斑马鱼Hcrt 神经元网络只由20 ～60 个脑神经元组成,因此造模简单,易于操作[42],但与人类在解剖结构、生理反应上均存在较大差异。

4 光遗传学模型

Williams 等[43]在食欲素原启动子下游插入修饰的Arch-3 gene,用1.5 kb 的Arch 片段替换Hcrt/nLacZ 构建体的LacZ基因,将其表达为与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresce protein,EGFP)的融合蛋白,从而获得转基因载体。 将转基因显微注射到BDF1 小鼠受精卵的原核中并培育出稳定的Hcrt/Arch 转基因品系,黄色光敏Arch-3 质子泵在Hcrt 神经元中发挥特异性抑制作用。 利用抗EGFP 抗体进行免疫组织化学双标,证实Arch 在Hcrt 神经元中的表达。 通过对该模型小鼠进行光照可以诱导潜伏期较短的睡眠,但诱导效果与转基因表达程度有关。 高水平Arch 表达影响了Hcrt 神经元兴奋性,模型小鼠表现出REM/NREM 潜伏期缩短,REM 睡眠延长,觉醒时间减少。 Hcrt/Arch 小鼠允许对Hcrt 神经元进行短期、可逆的操作,便于评估Hcrt 神经回路的特定方面及Hcrt 激活或抑制的后果。

5 免疫介导模型

5.1 脂多糖诱导的CCR3 基因敲除模型

趋化因子受体3(chemokine receptor 3, CCR3)是与发作性睡病相关的易感基因,其在发作性睡病患者外周血中的表达水平降低[44]。 CCR3 作为一种G 蛋白偶联受体,调节免疫细胞的定位及炎症细胞分泌的趋化因子梯度,在中枢神经系统中作为炎症介质发挥作用[45]。 Toyoda 等[46]发现与WT 小鼠相比,CCR3 基因敲除小鼠的Hcrt 神经元数量减少约10%,未产生发作性睡病的表现。 进一步使用革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作为免疫系统刺激物,腹腔注射入CCR3 基因敲除小鼠,小鼠出现REM 睡眠时间延长,NREM 睡眠时间缩短而发作次数增加。多项研究证实,LPS 能在给药后24 h 内改变啮齿动物的睡眠-觉醒模式[47-49]。 LPS 诱导的CCR3 基因敲除小鼠适用于研究由环境触发因素引起免疫介导的Hcrt 神经元退化,来理解发作性睡病的免疫发病背景。

5.2 CD8+T 介导的Hcrt 神经元损伤模型

发作性睡病与人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)等位基因HLA-DQB1*06:02 密切相关,98.4%的患者携带该基因,在发作性睡病患者的血清和脑脊液中已发现识别中枢神经系统表达不同抗原靶点的自身抗体[50-52]。 Bernard-Valnet 等[53]培育了在Hcrt 能神经元(称为Orex-HA)中特异性表达血凝素(hemagglutinin, HA)作为“新自身抗原”的小鼠,将Rosa26tm(HA)1lib 小鼠与Orex-Cre 小鼠杂交,在人食欲素启动子的控制下表达Cre,通过定量RT-PCR 方法检测评估HA 在Orex-HA 小鼠大脑不同部位的转录情况。 然后将自身抗原特异性的CD8+T(CTL)细胞注射到Orex-HA小鼠体内,组织学分析显示Orex-HA 小鼠下丘脑有密集的T 细胞浸润,在移植后第5 ～8 天达到高峰。15 d 后再次接受CTL,迅速出现明显的发作性睡病表型,包括猝倒发作,REM 潜伏期缩短、时间延长,觉醒次数减少。 CTL 与表达MHC-I 类Hcrt 神经元直接相互作用,导致细胞溶解颗粒极化,反复注射CTL 后,这种表型进一步加重[54]。 该模型适用于发作性睡病的自身免疫发病机制研究,且为探究免疫疗法提供了理论基础。

6 总结

NRL 是一种具有遗传易感性、受环境因素影响或触发的疾病,发病机制复杂。 动物模型是研发和测试新的NRL 疗法的基础。 目前已开发的动物模型主要通过基因工程或化学诱导等方法,造成下丘脑外侧区Hcrt 神经元特异性丧失,以模拟人类NRL的病理表现和临床特征,但由于实验动物与人类在基因调控、器官结构与细胞类型等存在一定差别,这些模型对NRL 治疗靶点的预测能力有限,仍需进一步验证。 如在O/E3 转录因子缺失模型中,通过静脉注射Hcrt-1 可逆转NRL 表型,但对于人类NRL患者使用Hcrt 神经肽并不可行,因其很难穿越血脑屏障[55]。 NRL 治疗发展的最终目标应是研发出一种针对该病病因,即自身免疫介导的下丘脑外侧区Hcrt 神经元退化。 因此,可进一步构建由自身免疫介导的NRL 动物模型,更准确地了解免疫系统对NRL 患者Hcrt 系统毁损的病理机制,从而为预防、治疗或阻止NRL 的发作提供相应的治疗靶点。

综上,虽然目前的动物模型不能完全概括人类发作性睡病的所有特征,但在揭示发作性睡病复杂病理机制及潜在治疗策略等方面,动物模型发挥了关键作用。 需要强调的是,动物模型应是人体复杂系统的简单表示,模拟疾病的特定方面,而决不是试图复制人类疾病的所有复杂性。 每个模型的优势很大程度上取决于该模型的评估目的,未来仍需基于研究目的继续探索更合适的动物模型。